大肠杆菌K99和F41菌毛抗原的不同缓冲液热处理提取方法比较的研究

本试验用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（Ｔ）、ＰＢＳ缓冲液（Ｐ）、生理盐水（Ｓ）和２Ｍ尿素ＰＢＳ缓冲液（Ｕ）以热处理的方法提取大肠杆菌Ｋ９９和Ｆ４１菌毛抗原,并用硫酸铵盐析纯化Ｋ９９以及用１Ｎ醋酸滴定和氯化镁沉淀分别纯化Ｆ４１。根据ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和蛋白质含量测定结果,四种缓冲液对Ｋ９９的提取量依次是Ｕ＞Ｓ＞Ｐ,而Ｔ检不出Ｋ９９;对Ｆ４１的提取量依次是Ｕ＞Ｔ＞Ｐ＞Ｓ。Ｋ９９纯化后取得了满意的纯化结果,Ｆ４１纯化后大量上样做电泳时仍有微细的污染带出现,而且氯化镁沉淀后造成Ｆ４１严重损失。Ｋ９９和Ｆ４１纯化前后的各个样品经超声波处理、０．５％脱氧胆酸钠处理和未处理的原液与自家因子血清做琼扩试验以及Ｋ９９和Ｆ４１做交叉琼扩试验,均具有良好的特异性,而且以超声波处理后的样品做琼扩试验效果最佳。     

大肠杆菌K99和F41菌毛抗原的不同缓冲液热处理提取方法比较 …

本试验用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（Ｔ）、ＰＢＳ缓冲液（Ｐ）、生理盐水（Ｓ）和２Ｍ尿素ＰＢＳ缓冲液（Ｕ）以热处理的方法提取大肠杆菌Ｋ９９和Ｆ４１菌毛抗原,并用硫酸铵盐析纯化Ｋ９９以及用１Ｎ醋酸滴定和氯化镁沉淀分别纯化Ｆ４１。根据ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和蛋白质含量测定结果,四种缓冲液对Ｋ９９的提取量依次是Ｕ〉Ｓ〉Ｐ,而Ｔ检不出Ｋ９９;对Ｆ４１的提取量依次是Ｕ〉Ｔ〉Ｐ〉Ｓ。Ｋ９９纯化后取得了满意的纯化结果,     

生物素标记大肠杆菌热敏感和热稳定毒素基因探针对猪鸡分离株的…

用特异的大肠杆菌热敏感毒素（ＬＴ）和热稳定毒素（ＳＴ）标记的基因探针，以硝酸纤维素薄膜为载体，对从猪、鸡玢离的大肠杆菌进行杂交。结果表明，在从猪分离的４８株大肠杆菌中，分离自黄痢的３５株、分离自白痢的２株，分离自ＳＰＦ猪粪便的６株均产ＬＴ和ＳＴ；分离自长期拉稀的育成小僵猪粪便的５株中，只有４株产ＬＴ和ＳＴ，１株既不产ＬＴ也不产ＳＴ。从鸡分离的２８株大肠杆菌中，分离自雏鸡的１４株ＬＴ阳性率为８６％，     

大肠杆菌新菌毛抗原的研究Ⅰ．菌毛抗原及其血凝活性测定

Ｎｏ．１和Ｎｏ．２两株大肠杆菌产生一种新菌毛抗原（暂定名Ｆ１９８７），并有性菌毛形成；菌毛直径３．６３６ｎｍ，性菌毛直径４．２ｎｍ。抗Ｄ－甘露糖血凝试验（ＭＲＨＡ）表明：本菌毛抗原具有独特的血凝谱，能稳定地凝集人（Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ）及貂的红血球，不凝集豚鼠、绵羊、山羊、马、牛、家兔、犬、貉子、小白鼠、鸡、鸽、鹌鹑等动物的红血球，对猪红血球凝集不稳定；血凝作用仅能被相应菌毛因子血清所抑制，不被Ｋ＿８８、Ｋ＿９９、Ｆ＿４１，及ＣＦＡ／Ⅰ、ＣＦＡ／Ⅱ等菌毛因子血清所抑制。血凝作用存在４℃－３７℃－４℃的凝集－解脱－复凝集现象。用Ｍｉｎｃａ培养基做３７℃培养１８～２４ｈ，可使菌毛抗原良好表达。在玻片凝集反应、反向间接血凝及反向间接血凝抑制试验中，本菌毛抗原与动物中常见的Ｋ＿８８、Ｋ＿９９、９８７Ｐ、Ｆ＿４１，及人源ＣＦＡ／Ⅰ、ＣＦＡ／Ⅱ等菌毛抗原不存在类属反应。     

仔猪腹泻大肠杆菌多价灭活苗的研究

根据广东省致仔猪腹泻的大肠杆菌血清型的调查结果，筛选出致病力强，免疫原性好的优势Ｏ抗原血清型菌株Ｃ４（Ｏ１１９），Ｄ３１（Ｏ６０）和Ｎ６（Ｏ７５）作为广东代谢菌株，与产粘附因子的菌株Ｃ８３９０１（中的Ｃ８３９１４Ｋ９９），Ｃ８３９１５（９８７Ｐ）制成多介灭菌苗，５批多价灭活菌苗对小鼠的平均保护率达９２．７％（３８／４１），９５０１批在兔体内粘附因子Ｋ８８，Ｋ９９，９８７Ｐ抗体效价可上升３ｌｏｇ２，     

仔猪腹泻大肠杆菌多价灭活苗的研究

根据广东省致仔猪腹泻的大肠杆菌血清型的调查结果，筛选出致病力强、免疫原性好的优势Ｏ抗原血清型菌株Ｃ４（Ｏ１１９）、Ｄ３１（Ｏ６０）和Ｎ６（Ｏ７５）作为广东代表菌株，与产粘附因子的菌株Ｃ８３９０１（Ｋ８８）、Ｃ８３９１４（Ｋ９９）、Ｃ８３９１５（９８７Ｐ）制成多价灭活菌苗。５批多价灭活菌苗对小鼠的平均保护率达９２．７％（３８／４１）。９５０１批在兔体内粘附因子Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ抗体效价可上升３ｌｏｇ２，母猪免疫一次后血清中粘附因子抗体效价上升０．８～１ｌｏｇ２。免疫比对照母猪所产的仔猪腹泻发病率显著降低（ｐ＜０．０１）；死亡率也降低。断乳均重增加０．３８Ｋｇ。     

K99和ST1双价保护性抗原基因重组苗条表达及其免疫原性研究

大肠杆菌耐热性肠毒素（ＳＴ１）是引起幼畜腹泻的重要毒力因子之一，其结构基因编码１９个氨基酸，无免疫原性。作者以ｐＳＬＭ００４工程菌株为始发菌株，亚克隆ＳＴ１基因，并将ＳＴ１基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因（ｐＳＫ２１９）和ｐＵＣ１８多克隆位点中（ｐＸＳＴ系列）。从而成功构建了能表达ＳＴ１－Ｋ９９两种抗原的工程菌苗候选株ｐＳＫ２１９以及能表达ＳＴ１抗原的工程菌株ｐＸＳＴ     

大肠杆菌K88,K99,987P,F41四粘附素联合苗的试用研究

本试验在海盐县的７个点对４１头具有连续黄痢病史的母猪在预期前前２１天左右应用大肠杆菌Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１四粘附联合苗进行免疫，结果受试的７个点中的５个点共计２４胎３２２头仔猪无一例黄痢发生，平均黄痢发生率为５．１％，比前一胎下降５７．５％，相应的死亡率和病死率分别为０．７％和１３．８％，比前一胎分别下降２３．５％和２４．９％。     

大肠肝菌K88、K99、987P、F41四粘附素联合苗的试用研究

本试验在海盐县的７个点对４１头具有连续黄痢病史的母猪在预产期前２１天左右应用大肠杆菌Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１四粘附素联合苗进行免疫，结果受试的７个点中的５个点共计２４胎３２２头仔猪无一例黄痢发生，平均黄痢发生率为５．１％，比前一胎下降５７．５％。相应的死亡率和病死率分别为０．７％和１３．８％，比前一胎分别下降２３．５％和２４．９％。     

兔EPEC菌株85002和85003菌毛及毒素的研究

应用乳鼠试验，皮肤蓝斑试验和仓鼠成纤维测定兔源Ｅ．ｌｏｌｉ菌株８５００２和８５００３，结果表明这两株兔源Ｅ．ｃｏｌｉ菌株不产生肠毒素ＬＴ和ＳＴ，但对仓鼠成纤维细胞有致细胞病变效应。用平凝集试验测定，这两株菌均与Ｅ．ｃｏｌｉｋ８８，Ｋ９９，９８７Ｐ和Ｆ４１的因子血清不邮现阳性反应。透射电镜观察，这两株菌的表面均有丰富的纤毛，８５００２菌株的纤毛为僵直的纤毛，８５００３菌株的纤毛为较长的，柔软弯曲的卷     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。     

ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析

用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１５０凝胶和ＤＥ３２离子交换层析，从重组菌ＰＧＥＭＳＴ２株内分离、纯化ＳＴ１肠毒素融合蛋白，回收的ＳＴ１肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白量的３１５％。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ＳＴ１肠毒素融合蛋白不溶于甲醇、乳鼠试验阴性。对小鼠皮下注射使用安全，对Ｋ９９强毒菌攻击贩保护率达６０％。ＰＧＥＭＳＴ２菌株可以做为预防仔猪腹泻疫苗的候备菌株     

牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株的抗原差异

用单克隆抗体（ＭＡｂ）作酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫荧光试验（ＩＦＡ）、病毒中和（ＶＮ）试验及兔疫沉淀试验证明了牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）致细胞病变株８７－２５５２（现地分离）与ＮＡＤＬ和Ｓｉｎｇｅｒ（原型株）之间的抗原差异。两个抗ＢＶＤＶ８７－２５５２株的ＭＡｂ（Ｄ１１和Ｂ７）能强烈中和现地分离株，并对该病毒的４８－ＫＤａ糖蛋白呈特异性。这两个ＭＡｂ有不同的亚型，Ｄ１１为免疫球蛋白Ｇ１     

猪肠毒性大肠杆菌（ETEC）病抗病育种研究

猪肠毒性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）是仔猪黄痢、白痢等腹泻疾病的主要病原菌，发病率和死亡率分别占总发病率和死亡率的５６．２％和２４．７％。按其特异菌毛产生的粘附素不同有Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ等多种类型，Ｋ８８又可分为ａｂ、ａｃ、ａｄ血清型，现已知ＥＴＥＣ Ｋ８８能否致病，取决于宿主小肠粘膜上皮细胞刷状缘有无受体，并受制于１对等位基因，有受体（敏感型）为显性（Ｓ），无受体（抗性型）为隐性（ｓ）。该痊点位于     

仔猪腹泻、水肿病疫苗预防仔猪白痢的效果试验

仔猪白痢是猪场的常见多发病,主要发生于６～２０日龄仔猪,引起肠炎及败血症,往往导致大批死亡。采用抗菌、止泻、补糖的综合疗法颇显费时费力。近年来,用疫苗对仔猪进行主动免疫逐渐普及。仔猪腹泻、水肿病疫苗含有引起仔猪黄白痢的大肠杆菌粘附素Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１和本地分离株抗原,可有效预防大肠杆菌及其他变异株引起的腹泻症。１　材料与方法１．１　试验用苗　仔猪腹泻、水肿病疫苗,规格为１５ｍｌ／瓶。１．２　试验猪　选产期相近的经产母猪２４头,随机分为２组,即对照组和试验组,每组１２头。１．３　试验…     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性敢管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列，应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２，分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行了ＰＣＲ扩增，结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增产生４５７ｂｐ的特异性片段，而ＴＫＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ     

蛋鸡非典型新城疫一例及其病原鉴定

１９９７年３月下旬，上海市郊区某蛋鸡场发生以产蛋下降为第一指征的非典型新城疫，通过临诊调查、抗体测定、病毒分离与鉴定进行了确诊。结果：感染鸡群产蛋下降的幅度可高达５０％；新城疫ＨＩ抗体滴度高达１２ｌｏｇ２或以上；用泄殖腔棉拭接种鸡胚的分离物用标准血清鉴定为新城疫病毒（ＮＤＶ），初代尿囊液的ＥＬＤ５０为１０－７．５（０．２ｍＬ），１日龄ＳＰＦ鸡胚脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄ＳＰＦ鸡静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）分别为１．７２５和２．３２，其毒力接近标准毒株—ＮＤＶ北京株Ｆ４８Ｅ９。     

犬瘟热病毒的结构多肽分析

差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化经鸡胚成纤维细胞蚀斑克隆后的犬瘟热毒Ｓ＿８毒株，采用ＳＤＳ－ＰＡＥＧ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ转印技术详细分析了犬瘟热病毒的结构多肽。回收凝胶中１条６３Ｋｄ的蛋白带，经３种不同的蛋白酶消化后，首次证明在犬瘟热病结构多肽中，融合蛋白Ｆ多肽的两个亚单位（Ｆ＿１和Ｆ＿２）是以胰蛋白酶的特异性水解位点精氨酸为桥梁连接形成Ｆ多肽的。试验结果表明，犬瘟热病毒主要包括Ｌ（２００．５Ｋｄ）、ＨＡ（７４Ｋｄ）、Ｐ（６８Ｋｄ）、Ｆ（６３Ｋｄ）、ＮＰ（５６Ｋｄ）、Ｍ（３５Ｋｄ）等６条结构多肽，同时下蛋白可在电泳中裂解成Ｆ＿１（４１Ｋｄ）和Ｆ＿２（２７Ｋｄ）２个亚单位。试验还发现其它３条分子量分别为５２Ｋｄ、４４Ｋｄ、３２Ｋｄ的病毒蛋白成分，它们是否均为病毒的结构多肽仍需深入研究。     

伪狂犬病病毒糖蛋白gp50基因的克隆和表达

从包含伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株ＢａｍＨＩ－７片段的重组质粒ｐＰＲ１２８中分离出含有完整糖蛋白ｇｐ５０基因的２．１ｋｂＤＮＡ片段，用ＫｐｎＩ和ＳｔｕＩ酶切后，将其酶切片段分别克隆到ｐＵＣ１９载体中，构建了２．１ｋｂ片段完整测序用质粒。对其序列进行分析，发现与文献报道结果一致，证明分离的ｇｐ５０基因是正确的。将包含ｇｐ５０基因的２．１ｋｂ和１．６ｋｂＤＮＡ片段分别插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的ｐＧＪＰ－５质粒Ｐ７．５启动子的下游，构建了ｐＧＢＴ５０－３６和ｐＧＢＴ５０－Ｓ２２个嵌合载体。将嵌合载体通过磷酸钙共沉淀法转染预先感染ＴＫ＋痘苗病毒天坛株的人ＴＫ－１４３细胞或ＣＶ－１细胞，进行体内同源重组。经蚀斑纯化，在ＢｄＵＲ选择压力下，通过光敏生物素标记的探针杂交，获得带有ＰＲＶｇｐ５０基因的重组痘苗病毒。用ＥＬＩＳＡ检测，重组痘苗病毒有特异性ＰＲＶｇｐ５０抗原存在。