不同品系条斑紫菜丝状体育苗试验

为进一步优化我国北方地区的条斑紫菜育苗技术,并筛选适宜的条斑紫菜种菜品系,于2018年5月-10月,在山东省烟台市牟平海边基地开展了黄优1号新品系、大连野生品系、青岛野生品系、赣榆生产品系、半叶紫菜共5个品系的条斑紫菜丝状体常温育苗试验,对育苗期间的温度、光照强度、营养盐等环境因子的调控方法进行了详细的记录,对育苗期间发生的病害及其防治方法和管理操作要点进行了总结。     

坛紫菜遗传连锁图谱的构建

以野生型坛紫菜纯系(♀)和红色型坛紫菜纯系(♂)作为杂交亲本,结合四分子分析法及单个体细胞克隆的丝状体途径,创建了由157个株系组成的坛紫菜DH作图群体,并用经过筛选的24对SRAP引物和16对SSR引物对父母本及作图群体各株系进行双标记分析,获得了224个多态性标记,其中157个标记符合孟德尔分离规律。根据标记间的连锁规律,首次构建了坛紫菜的分子遗传连锁图谱,所构建的遗传图谱由包含124个标记(含SRAP标记104个,SSR标记20个)的5个连锁群组成,总长度为879.2cM,平均标记间隔为7.09cM,各个连锁群长度为134.2～213.6cM,包含标记18～31个。最后采用3种不同方法计算得到坛紫菜的估计基因组长度平均为955.3cM,由此得到坛紫菜遗传连锁图谱的基因组覆盖率为92.0%。     

条斑紫菜品系评价方法的探讨

总结并分析了“国家级紫菜种质库”中有关紫菜种质材料的原始数据和资料,调查研究了条斑紫菜不同品系的形态结构等生物学特性及环境适应性表现;通过对条斑紫菜不同品系经济性状的定量测评、丝状体生长发育特征的测评、品系产品生化成分的分析评价以及分子标记技术在条斑紫菜种质评价分析中的应用等研究,初步得到了条斑紫菜品系的评价方法;筛选...     

条斑紫菜耐高温品系的特性分析与海区中试

通过室内培养和海区栽培实验验证条斑紫菜耐高温品系(T-17)优良性状的稳定性和栽培适用性。结果显示,与野生型品系(WT)相比,T-17品系的叶状体,在生长率、最大光化学效率、主要光合色素含量、藻体厚度和产量等方面均存在明显的优势。将在18℃下培养50 d的小苗再在18、22和24℃下培养35 d,T-17的绝对生长率分别为WT的17.71、15.81和33.00倍,特定生长率分别为WT的4.59、4.38和9.15倍,最大光化学效率分别为WT的1.17、1.29和1.58倍。WT的小苗在22、24和25℃下再分别培养25、15和10 d,叶片的颜色就转深变黑,藻体卷曲变硬,出现腐烂;而T-17的小苗在相同培养条件下培养相同的天数仍表现出良好的生长状态,藻体不变硬,无腐烂,说明T-17具有较强的耐高温性。此外,在日龄65 d的叶状体中,T-17的Chl.a和总藻胆蛋白(PE+PC)的含量分别是WT的1.45和1.54倍;T-17的平均厚度比WT减少26.4%。T-17的壳孢子放散量与WT相比差别不显著。在海区栽培试验中,T-17品系前4次收割的鲜菜总重量比当地栽培野生种(Wt)增加了16.3%,1~4次收割的鲜菜的最大光化学效率分别为Wt的1.06、1.12、1.17和1.27倍,而Chl.a含量分别是Wt的1.41、1.49、1.52和1.91倍,总藻胆蛋白含量分别是Wt的1.94、2.04、2.03和2.34倍。研究表明,与野生型品系相比,T-17品系在产量、品质和耐高温性等方面均明显提高,且性状稳定,生产适用性好,有望在生产上规模化栽培。     

条斑紫菜凝集素的化学修饰

为探索条斑紫菜凝集素(Porphyra yezoensis Ueda Lectin PYL)的作用机理,对纯化的条斑紫菜凝集素分子进行化学修饰,测定与其活性相关的氨基酸残基。结果表明,经碘乙酸、NEM、DTT修饰后的PYL,其凝集活性均未发生任何改变,表明分子中的自由巯基、二硫键与凝集活性无关。PYL经NEM修饰,有2.6个分子表面的自由-SH被修饰。在5mmol.L-1的NAI下,PYL凝集活性不变,但在10、20mmol.L-1 NAI时凝集活性分别丧失50%,75%,经羟胺处理后恢复部分活性,说明Tyr和氨基在PYL的凝集活性中起一定的作用;Glu和Asp的化学修饰,其凝集活性丧失93.75%,说明酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸是PYL凝集活性的重要组成部分。     

多个条斑紫菜品系采收期内脂肪酸组成、含量的变化分析

为探讨条斑紫菜不同栽培品系、不同采收期脂肪酸组成及含量的变化,本实验对10个栽培品系进行了跟踪测定分析,结果显示:条斑紫菜的脂肪酸组成稳定,与品系、采收期内季节性变化无关,但含量存在明显的差异。各品系的3个采收期的饱和脂肪酸(16∶0为主,包括13∶0、16∶0、18∶0)的相对含量约为20%;不饱和脂肪酸(以EPA为主,包括18∶1 n-9、18∶2 n-6、18∶3 n-3、20∶1 n-9、20∶2 n-7、20∶3 n-7、20∶4 n-6(AA)、20∶5 n-3(EPA))的相对含量为70%左右。在温度最低2月份的采收样品中,总脂肪酸和EPA含量最高,显示低温有利于条斑紫菜脂肪酸尤其是EPA的积累。另外,条斑紫菜富含以EPA为主的不饱和脂肪酸,在整个采收期内,样品中的n-6/n-3比值为4.9～7.7,符合WHO/FAO膳食推荐值。     

条斑紫菜两个耐高温品系的耐低盐特性

以条斑紫菜两个耐高温品系(YZ-4和TM-18)为对象,以野生型品系(WT)做对照,分析其叶状体在高温、低盐胁迫下的生长和光系统Ⅱ最大光量子产量(F_v/F_m)的数值,为筛选既耐高温又耐低盐的条斑紫菜抗逆品系提供依据。结果显示,在适宜培养条件(温度18°C和盐度26)下,YZ-4和TM-18叶状体在50～85 d的生长速率快于WT,F_v/F_m和主要光合色素含量均高于WT,各品系的绝对生长率和F_v/F_m之间均具有较高的正相关性。另外,WT叶状体在70 d左右开始形成精子囊时,绝对生长率和F_v/F_m明显下降。在高温胁迫下培养,各品系叶状体的F_v/F_m和绝对生长率均呈下降趋势,且胁迫的温度越高或时间越长,其降幅越大。在24°C高温胁迫35 d后,WT、YZ-4和TM-18的F_v/F_m分别下降了56.7%、43.2%和28.7%。在25...     

条斑紫菜耐高温杂交重组品系的筛选与特性分析

为改善条斑紫菜优良品系TM-18藻体颜色偏红的弱点,本研究以红色型突变品系(TM-18,特点:藻体偏红色;生长快,色素蛋白含量高,具有一定的耐高温性)为父本;绿色型突变品系(OMO-1,特点:藻体绿色,生长较慢,色素蛋白含量低,耐高温性差)为母本进行种内杂交,从杂合丝状体的F1叶状体中,分离出了优良品系TW-9。通过比较它与亲本品系的特性,获得以下结果:在常温(18°C)和高温(24和25°C)下培养13 d,TW-9品系的壳孢子存活率分别为TM-18品系的1.0、1.1和1.1倍,以及OMO-1品系的1.1、4.7和7.2倍。在18°C组,3个品系的壳孢子苗畸形率无显著性差异,但在24和25°C组,TW-9品系的畸形苗率比TM-18品系分别降低了20.3%和29.5%,比OMO-1品系分别降低了74.8%和69.5%。将在18°C下培养40 d的叶状体分别置于18、24和25°C再培养10 d,TW-9品系的绝对生长率分别为TM-18品系的0.9、1.5和0.8倍,以及OMO-1品系的1.4、1.5和28倍。此外,在24°C下培养25 d或在25°C下培养10 d,OMO-1品系的藻体腐烂严重,最后完全解体;TM-18和TW-9品系藻体在24°C下培养25 d只出现轻微卷曲,但在25°C下,TM-18品系培养15 d就腐烂至完全解体,而TW-9品系培养30 d也只是轻微腐烂。在18°C下培养40 d的TW-9品系叶状体分别再在18和24°C下培养15 d,总藻胆蛋白含量分别为61.5和77.8 mg/g,分别为OMO-1品系的1.4和1.4倍,但与TM-18品系的含量相比无明显差异。在18°C下培养55 d的叶状体平均厚度,TW-9品系为25.6μm,分别比TM-18和OMO-1品系降低了13.5%和17.7%。另外,3个品系的壳孢子放散量无显著性差异。研究表明,TW-9品系不仅具有与TM-18品系相似的特性,如叶状体生长快、色素蛋白含量高、壳孢子放散量大等特性,并且它的藻体更薄、更耐高温,其颜色与野生色相近,符合生产栽培的要求,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

新品种条斑紫菜的养殖技术

研究了新品种条斑紫菜的苗种培育、苗网解网、干燥、包装、入库等技术以及紫菜栽培海区的选择和栽培设施等技术关键,引用日本条斑紫菜育苗的技术工艺,采用高密度投放果孢子、丝状体恒温培育、回转式(水车式)采苗等技术,有效控制了出苗帘数量,缩短了育苗时间,提高了壳孢子的利用率,其综合技术经济指标达国内领先水平。     

条斑紫菜叶状体附生菌及病原菌的初步调查

对条斑紫菜叶状体进行微生态学调查,结果表明：在健康的叶状体上附着异养菌数量为106c．f.u／g,优势菌菌落为黄色和桔红色两种。具有降解琼脂特性的病原菌在健康叶状体上数量很少,它们主要附着于网绳上,这可能是引起紫菜脱落,特别是苗期严重脱落的主要原因。     

条斑紫菜双单倍体群体主要经济性状的遗传分析

条斑紫菜叶状体主要经济性状的遗传参数及相互间的遗传关系,是开展分子育种的基础。实验以条斑紫菜野生型品系(Py-WT2,父本)和红色突变型品系(Py-HT,母本)杂交后产生的杂合丝状体为材料,构建由152个品系组成的条斑紫菜双单倍体(DH)群体。该群体叶状体的6个经济性状(L50、W50、FW50、SGR-L、SGR-W、SGR-FW)的表型值用单样本Kolmogorov-Smirnov检验。结果发现,各性状均为数量性状。L50和SGR-W为超亲遗传性状,其余4个性状的变异介于双亲之间,其中W50偏向于母本,FW50、SGRL和SGR-FW偏向于父本。6个性状的变异系数介于21.11%~56.68%,均属中等强度变异。相关性分析表明,L50、W50和FW50相互之间均存在极显著正相关性,SGR-L、SGRW和SGR-FW相互之间也存在极显著正相关性。利用单因素方差分析法估算出L50、W50和FW50的遗传力分别为58.17%、64.00%和57.64%,控制3个性状的基因对数分别为6.61、12.63和8.09,遗传力(y)与基因对数(x)的二次回归方程为y=0.2922x~2–4.6533x+76.162(R~2=1)。基因间互作方式的检测结果显示,控制L50和控制FW50的多基因间均分别不存在互作;控制W50和控制SGR-W的多基因间均分别存在互补作用;控制SGR-L和控制SGR-FW的多基因间均分别存在重叠作用。研究表明,条斑紫菜叶状体L50和FW50的遗传力高、基因对数少且基因间无互作,可进行早代选择。另外,L50、W50和FW50之间的相关性高,可进行间接选择以提高育种效率。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

坛紫菜与长紫菜种间杂交后代的细胞崩溃现象与成活后代的表现型观察比较

坛紫菜壳孢子萌发的第一次和第二次分裂为减数分裂,结束后形成了一个基因型不同的四分体,随后由这个四分体发育成一个基因型嵌合的叶状体。由坛紫菜与长紫菜种间杂交所产生的杂合丝状体成熟后释放出壳孢子,后者在分裂初期出现了大量的细胞崩溃死亡,通过对单个的壳孢子萌发体进行定点跟踪观察后发现,细胞崩溃死亡不仅会发生在减数分裂的直接产物即处于二细胞期、三细胞期、四细胞期的萌发体,当细胞数大于4个的萌发体在进行有丝分裂时也会出现细胞崩溃死亡。绝大部分的壳孢子能进行第一次减数分裂,形成处于二细胞期的萌发体,随后进行第二次减数分裂,形成处于三细胞期或四细胞期的萌发体。培养4 d,78.6%的壳孢子已发育成含2~4个细胞的萌发体,其余为未分裂的壳孢子萌发体;在含2~4个细胞的萌发体中未出现细胞崩溃死亡的萌发体的百分率为99.7%,0.3%的个体出现了细胞崩溃死亡。随着培养时间的延长,大多数处于二细胞期的萌发体发育成处于三细胞期和四细胞期的萌发体,而大规模的细胞崩溃死亡也出现在处于三细胞期和四细胞期的萌发体中。培养14 d,处于三细胞期和四细胞期的萌发体的百分率分别为38.6%和37.2%,它们当中含有崩溃死亡细胞的个体百分率分别为99.5%和99.2%。此外,8.9%的萌发体能够发育成含4个以上细胞的个体,但在随后的有丝分裂中也出现了细胞崩溃死亡现象。培养35 d,大部分的萌发体其体细胞已全部崩溃死亡,但仍有约1%的萌发体能成活下来,可它们并非是由一个完整的四分体发育而来,而是由四分体中的1~2个成活细胞发育而来。培养45 d,可把成活体的形态和颜色分成类亲本型和重组型两大类。研究表明,利用紫菜种间杂交的后代在壳孢子萌发初期会出现细胞崩溃死亡的现象,不仅可以用于辅助更精确地鉴别物种,而且可以从其成活后代中筛选出具有重组优势的新品系。     

条斑紫菜在不同生长周期砷形态变化规律及其对砷的富集效应

首次研究了江苏省3个主产区条斑紫菜中总砷及各种形态砷的含量从1月至4月不同收割时期的变化规律以及条斑紫菜对砷的富集系数。结果发现,条斑紫菜中不同形态砷含量差异很大,以砷糖含量最高,占总砷含量的90.40%~98.14%;二甲基砷次之,无机砷含量最低,含量在0.054~0.14 mg/kg,三者之间具有显著性差异(P＜0.05)。2月份收割的紫菜样品总砷和砷糖含量最高,之后呈逐渐下降的趋势。而无机砷含量及其占总砷百分比则从1月至4月逐渐降低。条斑紫菜对砷具有极强的富集能力,富集系数在454.4~623.8。本研究进一步证明,条斑紫菜中无机砷含量远小于我国标准规定的无机砷限量。     

条斑紫菜基因组Fosmid文库构建

高分子量基因组文库是开展条斑紫菜基因组学研究的必备工具。构建了由23 040个Fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体无偏倚基因组文库。检测分析表明：文库克隆重组率为100%;插入DNA片段长度为28~40 kb,平均长度为35 kb,文库覆盖率约为条斑紫菜基因组的2.78倍;从超级池中筛查条斑紫菜18S rRNA、atpA、h2A、rbcL基因,至少能得到一个阳性克隆,印证了计算所推测的文库覆盖率;随机选取6个Fosmid克隆经100代传代后插入DNA片段未发生丢失或长度变化,表明克隆传代的稳定性。该文库的构建为开展条斑紫菜基因组特性分析和基因克隆奠定了基础。     

坛紫菜叶状体的抗生素联合除菌效果

为研究坛紫菜及其外生菌群对氯霉素、竹桃霉素和头孢噻肟3种抗生素的敏感性,通过将其与氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素的组合,优化坛紫菜叶状体的除菌方法,并利用涂布平板、qRT-PCR及16S rRNA测序分析其除菌效果。结果显示,当坛紫菜先以氨苄青霉素(300 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)和庆大霉素(100 mg/L)混合处理18 h,再以氯霉素(50 mg/L)、头孢噻肟(200 mg/L)和竹桃霉素(50 mg/L)混合处理4 d,叶状体的健康率保持在96.3%以上,而对可培养细菌的抑制率达到99.9%。根据qRT-PCR和16S rRNA的结果可知,该种组合方法较前3种抗生素的组合,其菌总数下降41.5%,微生物的丰度和多样性指数明显下降。其中,假单胞菌、交替赤杆菌、交替单胞菌以及海杆菌等得到针对性的抑制。研究表明,多种抗生素的优化组合能够对坛紫菜叶片的菌群结构产生显著影响,使其受到抑制,但仍无法达到绝对除菌的效果。     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

紫外辐射对条斑紫菜不同部位藻体光化学效率和光合色素含量的影响

实验室条件下研究了紫外辐射(UVR)对条斑紫菜藻体不同部位最大光化学效率(Fv/Fm)和光合色素含量的影响,以探讨条斑紫菜不同部位对紫外辐射反应的差异性。在全光谱 PAB(PAR+UV-A+UV-B,280~700 nm)和滤除紫外辐射UVR(UV-A+UV-B)的有效光辐射(PAR,395~700 nm)两种处理下进行测定。实验结果表明,PAB处理后的各部位藻体最大光化学效率下降程度均高于PAR处理后,且弱光期恢复程度低、速度慢。藻体不同部位间最大光化学效率下降程度也存在差异,藻体梢部对PAB的耐受性高,恢复也较快;基部耐受性最差,恢复也较慢。藻红蛋白(phycoerythrin,PE)和藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)对不同辐射处理较敏感,PAB辐射处理后,各藻体部位的PE、PC含量均显著上升(P<0.05),其中藻体梢部PAB处理后的PE、PC含量的均极显著升高(P<0.01)。然而不同部位藻体在PAB和PAR照射下,叶绿素a(Chl.a)和类胡萝卜素(Car)并无显著变化(P>0.05)。藻体的紫外吸收物质(MAAs)的含量从基部到梢部逐步升高,不同辐射处理前后,各藻体部位的紫外吸收物质也未显著增加(P>0.05)。总之,条斑紫菜不同部位藻体光合生理特性存在较大差异。推测条斑紫菜应对紫外辐射的策略有遮蔽作用,积累紫外吸收物质和动态光抑制作用。