供体细胞培养处理方法对水牛核移植效果的影响

以经常规培养法 (DMEM 10 % FCS)、血清饥饿法 (DMEM 0 .5 % FCS培养 5～ 10 d)和 Apidicolin- APD结合血清饥饿法 (0 .1mg/ L APD培养 2 4 h,DMEM 0 .5 % FCS培养 1～ 18d)培养处理的水牛卵巢颗粒细胞和水牛成体耳部成纤维细胞作供核 ,分别采取带下注核法和胞质内注核法进行核移植。同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率 (以颗粒细胞作供核 )以及重组胚的囊胚发育率无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但经 APD 0 .5 % FCS培养处理供体细胞核移植后的分裂率显著高于其他组 (P<0 .0 5 )。用 7%乙醇处理的成体耳部成纤维细胞进行核移植 ,其重组胚的分裂率和囊胚发育率与对照组 (不含乙醇 )均无明显差异 (P>0 .0 5 )。结果表明 ,(1)血清饥饿处理水牛供体细胞对其核移植效果没有影响 ;(2 ) DNA合成抑制剂 APD结合血清饥饿培养处理水牛颗粒细胞和成体耳部成纤维细胞 ,可提高其核移植效果 ;(3)乙醇预激活处理水牛成体耳部成纤维细胞 ,对其核移植效果没有影响     

水牛体细胞连续核移植的效果

为探讨水牛体细胞连续核移植的效果,以水牛胎儿成纤维细胞为核供体,进行了水牛体细胞连续核移植。结果显示,连续核移植的融合率显著高于原代核移植(87.9%vs76.2%,P<0.05),但两者之间的分裂率和囊胚率没有显著差异(P>0.05);这说明水牛体细胞核移植胚胎可被再次克隆而不降低其发育能力,水牛体细胞连续核移植是可行的。     

鲁西黄牛皮肤成纤维细胞分离与培养的研究

研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的分离与培养、纯化方法及生长特征,获得了传代培养的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞和上皮细胞.鲁西黄牛耳皮肤细胞在体外培养时呈贴壁生长,其原代或早期传代培养物由上皮样细胞与成纤维细胞混合组成.传代培养混合生长的细胞用0.25%胰蛋白酶液37℃下消化处理3～4 min,脱壁悬浮的主要为成纤维细胞.采用反复消化法在传代过程中将二者逐步分离纯化,获得了可正常传代的鲁西黄牛耳上皮细胞系和成纤维细胞系.通过绘制生长曲线研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的增殖规律.传代培养至12代的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞染色体倍性正常.利用第6代成纤维细胞作核供体克隆试验结果证明重构胚体外发育正常,囊胚发育率为27.3%.     

鲁西黄牛体细胞克隆保种技术的研究

以体外培养的鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞作核供体，研究利用体细胞克隆技术保存我国地方黄牛优良品种的技术方法。通过组织块培养法建立的鲁西黄牛（1♂，4♀）成纤维细胞系，作为核移植供体细胞，利用屠宰场母牛卵巢卵母细胞经体外培养成熟后作为核受体进行核移植，试验结果表明：重构胚的融合率为62．5％（242／387），分裂率为63．6％（154／242），体外培养第7天囊胚发育率为42．9％（66／154）。体外培养第7天的囊胚的内细胞团细胞（ICM）与滋养层细胞数平均为37和47，ICM占44．2％。体外发育到7d的囊胚新鲜胚胎的移植妊娠率（新鲜胚胎）移植受体10头，60d妊娠率为20％（2／10）。     

胎儿成纤维细胞的培养分离方法对猪体细胞核移植胚胎发育潜力的影响

研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%～80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);(2)猪胎儿成纤维细胞冷冻-解冻后的核移植分裂率和囊胚发育率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),但融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;(3)采用组织块法和酶消化法分离得到的胎儿成纤维细胞所构建的重构胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。表明100%长满汇合培养是较好的猪胎儿成纤维细胞培养处理方法;猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;组织块法和酶消化法均可用于分离培养猪体细胞核移植的胎儿成纤维细胞。     

季节对延边黄牛卵母细胞质量及体细胞核移植胚胎发育的影响

研究季节对延边黄牛卵巢质量和卵母细胞的数量、质量、体外成熟以及核移植重组胚发育的影响。持续1年采集延边黄牛卵巢,分级卵巢,抽取卵巢表面直径2～8mm的卵泡内的卵母细胞,收集后进行体外成熟和重组胚的体外培养。结果表明,1级卵巢的比例在春冬季时明显高于秋季（P〈0．05）,2级卵巢的比例在春夏季高于冬季（P〈0．05）,秋季的3级卵巢比例最高,与其他季节有显著差异（P〈0．05）;在秋冬季,平均每个卵巢拣出卵母细胞数高于春夏季（P〈0．05）,成熟率上,秋季显著高于春夏季（P〈0．05）,但与冬季并无差异且其他各组间无显著差异（P〉0．05）;卵裂率上,秋季与春季有差异（P〈0．05）,但与其他季节无显著差异（P〉0．05）,囊胚率上,各组之间均无显著差异（P〉0．05）。通过研究发现,季节对延边黄牛卵母细胞的可用回收数量及其质量都会产生影响且秋季为延边黄牛体细胞核移植实验最适合季节。     

融合液浓度梯度融合法提高延边黄牛体细胞克隆效率

延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,采用0.28mol/L蔗糖、甘露醇融合液。比较融合液浓度梯度融合法与普通融合法对延边黄牛体细胞克隆效率的影响。实验1,探讨0.28mol/L蔗糖融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(92.98%vs88.55%)、卵裂率(91.07%vs80.96%)、囊胚发育率(40.06%vs30.19%)均显著高于普通融合法。实验2,探讨0.28mol/L甘露醇融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(91.22%vs84.89%)、卵裂率(88.02%vs80.42%)、囊胚发育率(39.51%vs29.19%)均显著高于普通融合法。结果表明无论蔗糖还是甘露醇融合液,融合液浓度梯度融合法均能有效提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟及重组胚发育的影响

为了提高卵母细胞的成熟率及重组胚胎的发育率,在体外成熟液中添加了不同浓度的谷氨酰胺,研究谷氨酰胺对延边黄牛卵母细胞成熟的影响,并观察它对重组胚胎后续发育的影响,从中筛选出最佳的体外培养条件。结果表明,1.0 mmol/L的谷氨酰胺能够显著提高卵母细胞的成熟率,同时也能提高囊胚发育率。说明谷氨酰胺能够提高延边黄牛卵母细胞的体外成熟率,并能促进囊胚发育。     

提高猪囊胚后期贴壁能力的优化培养体系

为了提高猪孤雌囊胚贴壁率,试验从饲养层及培养液两方面研究猪孤雌囊胚贴壁能力;用小鼠、猪和牛的胎儿成纤维细胞制作饲养层,分别添加DMEM、NCSU-23、DMEM/NCSU-23培养液,探讨猪孤雌囊胚在3种饲养层上的发育效果。结果表明,BEF饲养层能更好地促进猪孤雌囊胚贴壁生长,其囊胚贴壁率为33.67%,与MEF饲养层组的囊胚贴壁率(19.08%)之间差异显著(P0.05),与PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05),MEF饲养层组和PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05);在BEF牛胎儿成纤维细胞饲养层组,用猪胚胎培养液NCSU-23培养猪孤雌囊胚后,囊胚贴壁率(22.53%)显著高于DMEM培养液组(10.41%)和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组(12.05%)(P0.05),DMEM培养液组和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组之间差异不显著(P0.05)。牛胎儿成纤维细胞饲养层和猪胚胎培养液NCSU-23能更好地促进猪孤雌囊胚后期贴壁。     

水牛和黄牛同种及种间显微授精(ICSI)的初步研究

试验探讨了水牛和黄牛同种及种间显微授精的可行性。体外成熟22~24 h的水牛和黄牛卵母细胞分别注入冷冻/解冻的尼里－拉菲水牛和利木赞黄牛精子,进行同种或种间的显微授精操作,构建的ICSI胚胎一部分培养到16~18 h固定染色检查原核形成情况,另外一部分胚胎培养2~9 d分别记录胚胎的分裂情况及囊胚发育情况。结果发现,水牛同种(水牛+水牛)和水牛异种(水牛+黄牛)显微授精胚胎的双原核率(47.73%和36.67%)、分裂率(68.00%和72.64%)和囊胚发育率(16.44%和22.39%)均无显著差异(P＞0.05);黄牛同种(黄牛+黄牛)和黄牛异种(黄牛+水牛)显微授精胚胎的双原核率(60.00%和45.28%)、分裂率(73.33%和71.31%)和囊胚发育率(28.57%和33.70%)亦无显著差异(P＞0.05)。以上结果表明:①水牛精子注射到黄牛卵子和黄牛精子注射到水牛卵子的种间授精胚胎均可以体外发育到囊胚阶段;②黄牛卵子无论同种和种间显微授精的效果均优于水牛卵子。     

甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对重组胚发育的影响。分别在体外培养液中添加0、7、14、21mmol/L的甘氨酸,结果表明,在体外培养液中添加甘氨酸能够显著提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,且以7mmol/L浓度的甘氨酸囊胚的发育率最高。     

FSH和LH对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚发育的影响

实验主要研究促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚发育的影响,从而提高延边黄牛体细胞克隆的效率。采集屠宰后延边黄牛卵巢,用抽吸法回收卵母细胞,然后在不同种类、浓度激素条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,最后将成熟的卵母细胞进行核移植及重组胚的体外培养。实验分别比较了在0、5、10、15、20μg/mL条件下,单独使用FSH与LH和在15μg/mL的FSH与10μg/mL的LH共同作用下对延边黄牛卵母细胞体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率的影响。结果表明:将卵母细胞单独置于加有浓度为15μg/mL的FSH和10μg/mL的LH的成熟液中培养,其成熟率及后期发育率优于其他浓度组(P<0.05);而2种最优浓度同时添加共同作用时要好于单独使用(P<0.05)。由试验可得出,成熟培养液中单独添加15μg/mL的FSH和单独添加10μg/mL的LH浓度对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚后期发育效果最好;使用最佳浓度进行协同作用时,其共同作用要好于单独使用的效果。     

藏野驴皮肤成纤维细胞分离培养及生物学特性分析

为了研究藏野驴成纤维细胞分离培养方法及生物学特性,以7岁龄藏野驴耳部皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行细胞原代培养,采用胰酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,通过细胞形态观察、生长曲线测定、细胞周期和免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果显示,成纤维细胞生长曲线呈“S”形,细胞生长状态良好,细胞特异性标记免疫荧光染色显示FSP-1呈阳性表达。结果表明,成功建立了藏野驴成体耳部皮肤成纤维细胞体外分离、培养和鉴定方法,为藏野驴种质资源保护、细胞水平及分子水平的研究奠定了基础。     

小鼠皮肤成纤维细胞的体细胞核移植

取成年小鼠唇部皮肤进行培养，分离成纤维细胞并血清饥饿培养1周，用作核供体。对成年小鼠进行超排，取卵母细胞用作核受体，核移植重构胚经SrCl2激活处理6h后，同mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞共培养，把发育到早期囊胚的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加ES细胞条件培养液，消化分离ICM，然后接种培养，对孵出的ES细胞样集落进行鉴定培养。结果显示，小鼠唇部皮肤成纤维细胞为核供体，核移植重构胚2-细胞率为54．05％，桑椹胚率17．14％，囊胚率6．90％，对照组卵丘细胞的核移植重构胚2-细胞率为60．00％，桑椹胚率21．85％，囊胚率11．69％，但2种供体细胞在支持核移植重构胚发育能力上差异不显著。成纤维细胞重构囊胚中6个囊胚分离出ES细胞样集落，3个ES细胞样集落可稳定传代；对照组卵丘细胞重构囊胚中9个囊胚中分离出ES细胞样集落，5个ES细胞样集落可稳定传代。从核移植重构胚中分离出的ES细胞样集落具有岛状或巢状群体生长形态，生长旺盛的集落可自发分化成单个散在或片状存在的上皮样或梭形细胞，碱性磷酸酶检测为阳性，常规冻存复苏，仍显示ES细胞特征。     

咖啡因和Scriptaid对绵羊核移植重构胚发育的影响

为提高绵羊体细胞核移植效率,以绵羊卵丘细胞为核供体,在融合后的核质互作期间加入咖啡因,在激活后对重构胚进行培养的过程中,加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid。结果表明:咖啡因浓度以2.5 mmol/L或5 mmol/L为宜,尽管卵裂率、桑椹胚率以及囊胚发育率与对照组差异不显著(P>0.05),但囊胚细胞数显著高于对照组(P<0.05);以0.2μmol/L Scriptaid处理组囊胚发育率最高,达24.31%,显著高于对照组和0.8μmol/L Scriptaid处理组(P<0.05),但与0.4μmol/L Scriptaid处理组相比差异不显著(P>0.05);囊胚细胞总数以0.2μmol/L Scriptaid处理组最高,显著高于0.8μmol/L Scriptaid处理组(P<0.05),但是与对照组和0.4μmol/L Scriptaid处理组差异不显著(P>0.05)。以上结果表明,咖啡因处理对绵羊核移植重构胚的囊胚发育率无显著影响,但可以显著提高囊胚细胞总数;Scriptaid可以显著提高绵羊核移植重构胚的囊胚发育率。     

Scriptaid和TSA对牛体细胞核移植重构胚发育效果的影响

为探讨一种新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理核移植重构胚时对其发育能力的影响,本研究以牛卵丘细胞为核供体,对获得的核移植重构胚分别用Scriptaid和曲古抑菌素(TSA)处理,统计其胚胎发育效果。结果表明:TSA以0.1μmol/L为宜,与对照组相比,尽管卵裂率无显著性差异(P0.05),但囊胚发育率显著提高(26.53%vs 18.00%,P0.05);Scriptaid处理组以0.4μmol/L囊胚发育率最高(27.08%),显著高于对照组(15.56%,P0.05)。对0.1μmol/L的TSA和0.4μmol/L的Scriptaid处理牛核移植重构胚发育结果进行比较,发现0.4μmol/L的Scriptaid处理组囊胚率(27.18%)显著高于0.1μmol/L的TSA处理组(23.39%,P0.05)。可见,组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid和TSA处理均可显著提高牛核移植重构胚的囊胚发育率,并且Scriptaid处理效果优于TSA(P0.05)。     

序贯培养液G1/G2对山羊核移植胚胎发育和质量的影响

为了优化山羊核移植胚胎体外培养体系,提高核移植效率,本研究检测了山羊体细胞核移植(SCNT)胚胎在序贯培养液G1/G2中的发育率和囊胚细胞凋亡,以及核移植胚胎移植后的妊娠率,以传统mSOF-FBS培养液作为对照组,评估序贯培养液G1/G2支持山羊核移植胚胎的发育能力。结果显示,与对照组相比,G1/G2组的囊胚发育率差异不显著((27.7±3.1)%vs(25.3±1.0)%,P>0.05),囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡率显著降低(分别为(93.2±4.5)vs(109.1±6.2)和(4.9±0.2)%vs(11.3±0.1)%,P<0.05),但移植后的妊娠率显著增高(21.4%vs 8.0%,P<0.05)。结果表明,与传统的培养液mSOF-FBS相比,序贯培养液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的发育。     

精子提取液对绵羊同异种核移植重构胚的激活效果

应用绵羊精子提取物体外激活绵羊体细胞核移植胚和山羊-绵羊异种核移植胚，比较了不同浓度的绵羊精子提取物对绵羊同种和异种重构胚的激活作用，并与传统的化学激活方法对重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数做了比较。结果表明，绵羊精子提取物可以有效地激活绵羊体细胞核移植胚和山羊-绵羊异种核移植胚，每一重构胚注射3pL浓度为5mg／mL的绵羊精子提取物，对同种和异种胚的发育效果均为最好，并显著高于其他试验组（P〈0．05）。注射绵羊精子提取物对绵羊-山羊异种核移植胚的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响，与离子霉素联合6-DAMP激活法差异不显著（P〉0．05）。注射绵羊精子提取物对绵羊同种核移植胚的卵裂率和囊胚率的影响，与离子霉素联合6-DAMP激活法差异也不显著（P〉0．05），但精子提取物注射法的绵羊核移植胚的囊胚细胞数显著（P〈0．05）高于化学激活法的细胞数（72．4vs65．2）。     

核移植前激活受体卵子对牛核移植卵体外发育的影响

本研究探讨了核移植前对受体卵子进行激活、细胞融合开始时间及供体受精卵细胞周期调节对核移植卵体外发育的影响。其结果显示核移植前对受体卵子激活组的细胞融合率与对照组没有差异 ,但重组胚胎的卵裂率、8～ 16细胞期胚胎及囊胚的发育率比对照组明显提高 ;核移植前激活的受体卵子分别在卵子体外成熟开始的第30h和 4 5h与供体细胞进行细胞融合 ,结果 ,30h组的细胞融合率和卵裂率与 4 5h组没有差异 ,但发育到 8～ 16细胞期及囊胚的发育率均比 4 5h的高 ;将供体受精卵用诺考达唑 (Nocodazole)处理后 ,进行核移植的结果 ,处理组的细胞融合率、卵裂率、发育到 8～ 16细胞期和囊胚的发育率与对照组无差异     

银狐垂体细胞系构建研究

分别采用组织块法和消化法2种接种方法进行银狐垂体细胞系构建研究。在消化法中使用不同浓度的胰蛋白酶来检验效果,同时在原代培养期使用反复差速贴壁法纯化,传代培养期结合使用反复差速贴壁以及两步消化法进行处理。结果表明：组织块法接种后成纤维细胞生长明显,原代培养后期成纤维细胞已为主要细胞;降低胰蛋白酶浓度能降低对细胞损伤,但消化时间会增长;采用消化法接种在抑制成纤维细胞生长方面效果好于组织块法。纯化效果上,结合反复差速贴壁法与两步消化法处理后获得了较好的效果,在原代培养时期能较好去除成纤维细胞并通过持续使用该方法可在传二代后获得较高纯度的细胞,纯度能达到80%以上,能够建立细胞系。