甘蓝型油菜MAPK1在损伤和病原菌胁迫下的表达模式分析

【目的】分析BnMAPK1组织特异性表达特征,探究其在损伤和病原菌胁迫下的特征及参加的信号途径。【方法】在电子克隆的基础上,克隆BnMAPK1的启动子序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BnMAPK1的诱导表达特征。【结果】从甘蓝型油菜中克隆了MAPK1的启动子序列,发现它含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件。还发现植物激素茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和过氧化氢（H2O2）,及损伤（wound）和核盘菌（sclerotinia sclerotiorum）均能在转录水平上激活BnMAPK1。甘蓝型油菜在损伤和接种核菌盘后,JA信号途径标志基因PDF1.2的表达量被诱导上升,而SA信号途径标志基因PR-1被抑制,推测甘蓝型油菜可能是通过茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号途径响应损伤和病原菌入侵。【结论】甘蓝型油菜MAPK1受多种植物激素和胁迫的诱导,并且其启动子中含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件,可能MAPK1在植物体抵抗外界多种胁迫中起重要作用,并且甘蓝型油菜可能是通过JA信号途径对损伤和病原菌入侵做出响应。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410 bp, 该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE 在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB 结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410 bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

杂交鹅掌楸LhFB1基因启动子的克隆及活性分析

【目的】研究杂交鹅掌楸LhFB1基因启动子(pLhFB1)的活性,为研究该基因功能及相关机制提供参考。【方法】利用染色体步移法(Genome Walking)克隆LhFB1基因上游5′侧翼调控区序列,利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的顺式作用调控元件。构建pCAMBIA1300-pLhFB1重组载体,对本氏烟草幼苗期叶片进行瞬转注射和GUS染色表达。花序浸染法将重组载体转化至野生型拟南芥,GUS组织染色分析其在T_2代转基因植株开花期根、茎、叶和花组织中的表达量,并用qRT-PCR对GUS组织染色进行活性验证。【结果】pLhFB1启动子序列长1 780 bp,含有多个TATA-box和CAAT-box及压力响应、激素响应、光信号转导、代谢循环元件。瞬转结果表明,烟草叶片注射部位有蓝色斑点,说明启动子有活性。遗传转化结果表明,转pLhFB1启动子拟南芥根、茎、叶和花组织中都有不同程度的蓝色,且根和茎中的蓝色斑块较深。qRT-PCR结果说明,pLhFB1启动子在拟南芥根、茎、叶和花组织都有表达,与GUS染色结果基本相符。【结论】克隆得到pLhFB1启动子序列,其在转拟南芥植株各组织中都有活性,但以根和茎中较强。     

茶树CsMAPKK3基因克隆及表达分析

【目的】克隆茶树CsMAPKK3基因,并进行表达分析,为探究CsMAPKK3基因的生物学功能及其抗逆分子机制提供理论支持。【方法】以铁观音为材料,采用RT-PCR克隆其CsMAPKK3基因的全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在不同组织及逆境胁迫下的表达情况。【结果】克隆获得的CsMAPKK3基因（GenBank登录号:AUD40506.1）cDNA序列全长1941 bp,包含完整开放阅读框（ORF）,长度为1557 bp,编码518个氨基酸残基,蛋白相对分子量为57.52 kD,理论等电点（pI）为5.39,为无跨膜螺旋结构和信号肽的不稳定蛋白,含有多个磷酸化位点,定位于细胞质和细胞核中,属于PKc类型的MAPKK,且具有SPS1、S_TKc等催化结构域,以及D（I/L/V）K激活域和S/T-X_3-5-S/T保守域,与中华猕猴桃PSS35243.1亲缘关系最近,且与拟南芥B亚家族聚为一类。CsMAPKK3基因起始密码子上游1714 bp的启动子区序列含有光响应、逆境响应、植物激素和厌氧诱导等相关的顺式作用元件。CsMAPKK3基因在根、茎、叶、花和果中均有表达,其中在茎和果的表达量较高,显著高于在花中的表达量（P<0.05）,但与根和叶中的表达量均无显著差异（P>0.05）。低温胁迫抑制CsMAPKK3基因表达,而脱落酸（ABA）、高盐和干旱胁迫均能诱导CsMAPKK3基因上调表达。【结论】CsMAPKK3基因表达具有组织表达特异性,且参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应等逆境胁迫的分子调控。     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。     

陆地棉GhWRKY33的克隆及抗旱功能分析

【目的】通过克隆陆地棉GhWRKY33并研究其抗旱功能,为棉花抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】利用同源克隆的方法从陆地棉中棉所10号中克隆GhWRKY33的开放读码框(open reading frame,ORF),并进行生物信息学分析,分析该基因的二级结构、亲疏水性,预测磷酸化位点和启动子区域的顺式作用元件,在NCBI中通过BLASTP检索同源性高的蛋白序列进行序列比对并构建系统发育树;构建35S::GhWRKY33-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导注射烟草叶片,观察荧光信号;利用qRT-PCR检测基因的组织表达特异性,以及干旱、ABA、JA、ET处理下的基因表达模式;构建GhWRKY33过表达载体并转化拟南芥,利用20%PEG6000对野生型和T3代转基因拟南芥进行干旱处理,观察处理后野生型和转基因拟南芥的表型,并测定脯氨酸和丙二醛含量等生理生化指标,分析目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平。【结果】从陆地棉品种中棉所10号克隆获得GhWRKY33的ORF全长为1 533 bp,编码一个含510个氨基酸残基的蛋白,含有2个WRKY...     

玉米ZmLTP3基因启动子的克隆及功能分析

植物转脂蛋白(LTPs)参与多项生理功能,但关于其在非生物胁迫中的作用及调控机制鲜有报道。前期研究发现,转玉米Zm LTP3基因的拟南芥抗盐性得到了提高。通过克隆得到Zm LTP3基因上游1 302 bp的启动子序列,Plantcare在线分析发现,在克隆序列中含有CAAT-box、TATA-box等启动子必需作用元件,除此之外还含有众多响应生物胁迫、非生物胁迫的元件。将启动子序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因相连,构建植物表达载体,转化拟南芥。转基因拟南芥GUS组织化学染色结果表明,该启动子序列具备启动子活性。研究结果可为后续深入研究Zm LTP3基因的作用及上游调控机制奠定基础。     

白桦BpSAUR24-like基因启动子克隆及表达特性分析

Small auxin-up RNA(SAUR)基因作为生长素的早期响应基因之一，其在植物顶钩发育、细胞扩增及生长素转运等多方面发挥作用。研究白桦中BpSAUR24-like基因启动子中顺式作用元件、组织表达特性及对不同激素的应答反应，可为进一步探究BpSAUR24-like基因功能奠定基础，也可为白桦分子设计育种提供理论依据。试验以白桦全基因组DNA为参考，预测BpSAUR24-like基因的上游1 501 bp为启动子序列，利用PLACE在线软件对BpSAUR24-like基因启动子序列含有的顺式作用元件进行预测，构建BpSAUR24-like基因启动子融合GUS基因的植物表达载体进行拟南芥遗传转化，对转基因拟南芥进行GUS染色。以野生型白桦生根苗的顶芽、第一叶片、第二叶片、第三叶片、幼茎、成熟茎和根为材料，进行实时定量PCR,探究BpSAUR24-like基因组织表达特性。分别用IAA、ABA和GA₃处理野生型白桦，探究BpSAUR24-like基因对不同激素的应答反应。结果表明，通过PCR成功克隆了BpSAUR24-like基因上游1 501 bp启动子序...     

盐芥GRP7基因的克隆和逆境表达分析

【目的】从抗逆植物盐芥中分离GRP7(glycine-rich RNA-binding protein7,GRP7)基因,为进一步揭示GRPs基因在盐芥逆境应答中的作用机制及生物学功能奠定基础。【方法】利用盐芥GRP7基因的EST序列设计特异引物,克隆GRP7基因的全长序列,对其保守结构域和系统进化树进行分析,并对TsGRP7基因的启动子区进行预测;利用qRT-PCR技术,检测GRP7基因在不同逆境胁迫、不同组织中的表达情况。【结果】TsGRP7基因编码区全长522bp,编码173个氨基酸;TsGRP7蛋白的N端第9~82位氨基酸之间有1个RNA识别基序(RRM),RRM中含有保守的RNP-1和RNP-2亚结构域;多重序列比对和系统进化树分析表明,盐芥和拟南芥亲缘关系较近;启动子序列分析表明,盐芥GRP7启动子区含有HSE热激响应元件、LTR低温应答元件等多个逆境相关的顺式作用元件,表明盐芥GRP7基因参与逆境响应。qRT-PCR分析表明,盐芥GRP7基因在不同逆境胁迫条件及不同组织中表达不同。【结论】盐芥GRP7基因参与低温、高盐、PEG等逆境响应。     

家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析

【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。     

木薯MePP2CAa基因克隆、表达及蛋白互作分析

为探究2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C， PP2C）在木薯响应非生物胁迫过程中的作用，利用木薯Arg7叶片cDNA扩增MePP2CAa基因，分析该基因序列、启动子活性、不同逆境和激素处理下的表达模式以及与ABA受体PYLs之间的互作关系。序列分析结果显示，MePP2CAa基因全长1 311 bp，编码436个氨基酸，具有PP2C家族的结构域特征，与橡胶树和麻风树的PP2C序列同源性最高，分别为78.95%和74.09%，在C端保守；qRT-PCR分析结果显示，MePP2CAa基因在木薯储藏根中的表达显著高于茎、叶中的表达量；不同逆境和激素处理结果显示，甘露醇、NaCl、ABA、MeJA、低温和SA处理可以显著诱导MePP2CAa基因的表达；MePP2CAa基因启动子序列分析显示，启动子包含ABA应答元件（abscisic acid responsive element，ABRE）、MeJA响应元件、干旱诱导元件等；酵母双杂交结果显示MePP2CAa能够与MePYL1互作。以上结果表明，MePP2CAa基因可能响应木薯的非生物胁迫。     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。     

水稻脂氧合酶-3基因启动子的特性分析

从栽培水稻品种越光中克隆了水稻脂氧合酶-3基因(Lox-3)的启动子,长度为1343bp,其序列与日本晴对应的序列完全相同。生物信息学分析表明,该启动子序列中包含受信号诱导的元件(G-box)、温度响应元件(CCGAAA)和水分胁迫响应元件(CACATG)等顺式作用元件;进一步构建了Lox-3基因启动子与gus和gfp基因的融合表达载体并获得转基因植株,发现报告基因在转基因植株的根、茎、叶、花药、种胚及种皮中均有表达,在萌发种子的胚和胚芽中也有表达,但在胚乳中不表达。此外,经ABA、NaCl及人工陈化处理后对报告基因的表达进行了定量分析,发现这些非生物胁迫可能通过诱导启动子顺式元件致使报告基因表达活性增强。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

山葡萄VaERF095基因表达及其启动子功能分析

【目的】克隆山葡萄乙烯响应因子基因VaERF095及其启动子序列,分析在低温和外源激素诱导下该基因的表达模式和启动子活性,为深入探究VaERF095基因参与低温胁迫响应机理提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法从山葡萄品种左山-1中获得VaERF095基因及其启动子,并通过实时荧光定量PCR检测VaERF095基因在低温（4℃）胁迫和外源激素诱导下及不同组织中的表达情况。同时构建VaERF095基因启动子融合GUS蛋白表达载体,瞬时转化葡萄叶片,通过β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性定量分析VaERF095基因启动子受低温胁迫和外源激素诱导的表达情况。【结果】从山葡萄克隆获得VaERF095基因,编码区（CDS）全长393 bp,编码130个氨基酸残基,该蛋白含有1个保守的AP2/ERF结构域,与欧洲葡萄和河岸葡萄的亲缘关系较近,氨基酸序列相似性分别为100.00%和93.08%。Va ERF095基因可响应低温和外源激素乙烯（ET）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）的诱导,呈现出不同的表达模式。VaERF095基因在老叶、茎、花序、卷须和果实均有表达,其中在卷须中...     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

【目的】锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）在植物非生物胁迫应答中起重要的作用,研究两个锌指蛋白基因MiZAT10A和MiZAT10B转入拟南芥对盐、干旱、重金属以及外源激素等非生物胁迫的应答,为抗逆育种提供理论依据。【方法】利用在线软件PLACE和MEME分别对芒果MiZAT10A和MiZAT10B进行启动子顺式作用元件以及motif预测和分析,并利用TBtools软件和‘四季蜜芒’基因注释文件（GFF文件,未公开）绘制染色体定位图;通过实时荧光定量分析MiZAT10A和MiZAT10B的组织表达模式;构建芒果MiZAT10A和MiZAT10B超量表达载体,采用农杆菌花序浸染法转化模式植物拟南芥,观察并记录转基因拟南芥开花表型以及在盐、干旱、重金属以及外源激素脱落酸和赤霉素处理下的根生长情况。【结果】启动子顺式元件分析显示,两个基因的启动子区域都有许多光响应元件、激素响应元件和非生物胁迫响应元件。表达模式分析显示,MiZAT10A与MiZAT10B在芽和花中表达水平最高。MiZAT10A和MiZAT10B分别获得了9株和14株转基因拟南芥,开花表型分析显示,Mi...