花生黄烷酮3-羟化酶基因AhF3H的克隆和表达分析

利用花生转录组测序结果和GenBank EST数据库,首次从花生中克隆了黄烷酮3-羟化酶基因,命名为AhF3H,GenBank登录号为KF312218。氨基酸序列分析表明,AhF3H与其他植物F3H有较高的同源性。进化树分析表明,AhF3H与大豆、野生大豆F3H的亲缘关系较近。在花生紫色种质材料及丰花1号中,AhF3H的相对表达水平同花青素含量呈正相关,表明AhF3H在花生花青素合成代谢过程中具有重要作用。     

核桃黄烷酮3-羟化酶基因cDNA 3′端的克隆与序列分析

从核桃(Juglans regia)中首次克隆得到黄烷酮3-羟化酶基因的cDNA片段,并命名为JrF3H,GenBank登录号为FJ966204.JrF3H长1 029 bp,编码342个氨基酸.蛋白质序列多重比对结果表明,推导的JrF3H蛋白质与其他植物F3H蛋白质具有很高的相似性,JrF3H蛋白质与茶学、拟南芥、大豆、烟草、小麦和银杏F3H蛋白质序列的同源性分别为86%、85%、85%、82%、80%和79%.此外,JrF3H在相似的位置存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点.F3H系统进化树表明,JrF3H与乔木类植物的F3H基因聚类关系最近.JrF3H基因的克隆将有助于弄清该基因在核桃黄酮代谢途径中所起的作用.     

黄烷酮3-羟化酶基因表达分析及转基因大豆新种质创制

黄烷酮3-羟化酶(F3H)是大豆异黄酮代谢途径重要酶类。研究F3H在不同大豆品种中的表达差异,并应用转基因途径创制新种质是提高大豆异黄酮含量的重要途径。以高异黄酮含量大豆品种中豆27和低异黄酮含量大豆品种楚秀为试材,采用q PCR技术,分析F3H在大豆不同发育时期、组织部位中的表达差异;并利用花粉管通道转化技术,获得转F3H阳性植株。结果表明:F3H在2个大豆品种R1~R7期叶片中的表达模式不同,中豆27的F3H表达量在R1期最高,而后开始下降,R2~R5期维持较低水平,R6期略有上升,R7期又出现下降;楚秀F3H表达量在R1~R4期较低,R5期出现表达高峰,R6期开始下降。F3H在2个大豆品种R5~R8期籽粒中的表达模式基本相同,表达量均从R5期开始下降,且R6~R8期维持较低水平。基于此,构建F3H RNAi反义载体,并利用花粉管通道技术转入不同大豆品种,获得了5个转基因新材料。     

山葡萄F3’5’H基因的克隆与表达及其启动子5′端缺失片段的功能分析

通过克隆山葡萄（Vitis amurensis）类黄酮-3’5’-羟化酶（flavonoid-3’,5’-hydroxylase,F3’5’H）基因及其启动子,并进行基因的原核表达和启动子不同缺失片段的瞬时表达,研究山葡萄不同种类花色苷的形成机制。克隆得到F3’5’H基因全长1 527bp,分析其理化性质发现,‘双红’品种F3’5’H较‘双丰’品种有所差异,通过对F3’5’H重组蛋白体外表达条件的探究,在温度为25℃、培养时间为11h且IPTG浓度为0.8mmol·L-1的条件下,目的蛋白在上清样品中有与预测重组蛋白分子量大小一致且较高浓度的表达带。山葡萄F3’5’H基因启动子序列共1 271bp,启动子序列中除具有核心启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还有一系列光响应元件。采用启动子缺失技术研究不同长度缺失片段启动子在烟草中的瞬时表达,发现随着F3’5’H启动子缺失片段长度的增加,GUS酶活性呈先上升后下降的趋势。     

万寿菊番茄红素β-环化酶基因及其启动子克隆和功能分析

【目的】克隆万寿菊番茄红素β-环化酶基因和其启动子,进行生物学信息分析,并预测启动子功能,为万寿菊类胡萝卜素的代谢机制和叶黄素含量的调控提供参考依据。【方法】通过RT-PCR技术从万寿菊总RNA中克隆得到TeLCYb的cDNA序列;应用生物学方法分析其DNA序列及其编码蛋白质序列特征,使用DNAMAN和在线软件Box Shade对其氨基酸序列同源性比对分析,并利用MEGA6.0构建进化树,分析其亲缘关系;根据其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其启动子序列,利用Plant Care在线数据库分析万寿菊TeLCYb启动子调控元件,构建启动子缺失表达载体pTeLCYb(-1969)∷GUS和pTeLCYb(-1140)∷GUS,利用农杆菌介导法侵染烟草,以GUS为报告基因研究不同调控元件的活性。【结果】从万寿菊中成功克隆TeLCYb,生物信息学分析发现,其全长共1 865 bp,开放阅读框为1 527 bp,编码508个氨基酸,氨基酸序列同源比对结果表明其与西洋蒲公英和菊花的同源性最高,且具有LCYb蛋白质特有的保守功能位点和特征多肽序列,在进化上与菊科单独聚为一枝。在已知基因序列的基础上获得长度为1 806 bp的TeLCYb启动子序列,生物学信息分析表明:该启动子除包含核心启动子元件TATA-box、CAAT-box外,还含有多种光应答元件和激素响应元件,其中光响应元件有13个,激素响应元件有5个,此外还具有MYBHv1结合位点元件、耐热响应元件、生理调控作用元件等顺式调控元件。GUS化学组织染色结果显示不同长度启动子均能够驱动GUS在茎、叶、花药及柱头中表达,但不同组织GUS染色蓝色斑点深度不同,其中花器官中花药和柱头中GUS酶活性最强;相对于启动子pTeLCYb(-1969),pTeLCYb(-1140)启动子还能够驱动GUS在根、叶和花萼中特异性表达,且各组织中GUS酶活性明显强于启动子pTeLCYb(-1969)的GUS化学组织染色结果。【结论】不同长度TeLCYb启动子均能驱动下游GUS的表达,但启动子的作用部位和作用强度存在差异,推测在ATG上游1 140 bp和164 bp区间的光响应元件可能具有增强子的功能,而全长启动子特有的激素响应元件和热响应元件可能具有抑制或降低启动子功能的作用。     

矮牵牛查尔酮黄烷酮异构酶（chiA）基因启动子的克隆和测序

通过ＰＣＲ扩增,从矮牵牛中克隆了能在花瓣、花药、花粉中特异表达的查尔酮黄烷酮异构酶（ｃｈｉＡ）基因启动子,序列分析表明该启动子含１３０５个核苷酸,与国外报道的序列完全一致。     

CiF3H基因克隆及功能分析

黄烷酮-3-羟化酶(F3H)是类黄酮合成途径的中枢位点,调控代谢途径中黄酮醇和花青素合成。文章根据转录组数据库中F3H基因中间片段设计特异引物,以中间锦鸡儿cDNA为模板,克隆得到CiF3H基因全长,通过序列分析、系统进化分析加以确认。qRT-PCR检测分析发现,中间锦鸡儿CiF3H基因受紫外、NaCl和ABA等胁迫诱导时表达模式具有相同规律。CiF3H基因在叶和根中表达量相当,茎中较少。异源表达CiF3H基因拟南芥的总黄酮含量少量增加,花青素含量降低。     

山葡萄黄烷酮3-羟化酶VamF3H基因及其克隆

采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法,从山葡萄果皮中克隆到黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的c DNA全长序列。该基因全长1 398 bp,包含1 092 bp的完整开放阅读框,编码363个氨基酸,相对分子质量为40.81 ku,等电点(PI)值为5.37。二级结构预测表明,随机卷曲是Vam F3H蛋白最大量的结构元件,不具有信号肽,属于不稳定亲水蛋白。氨基酸序列与欧亚种葡萄(FQ389950)、圆叶葡萄(KF040970)、美国蔓藤(JX087441)等的F3H类基因同源性较高,相似性分别为99%、99%、96%。     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白（SRPP）基因启动子的克隆及其功能分析

小橡胶粒子蛋白(SRPP)是巴西橡胶树中参与橡胶生物合成的重要蛋白因子之一。SRPP的氨基酸序列与橡胶延长因子(REF)和菜豆胁迫相关蛋白(PVSRP)的同源性分别为72%和68%。为了进一步研究SRPP基因表达及其调控的机制,作者采用接头连接介导的PCR散步法(ligation-mediated PCR),克隆了SRPP基因的启动子。序列分析表明,SRPP基因启动子中与光诱导相关的顺式元件占39%,可能属于光诱导型启动子,因此,SRPP基因的表达可能受光信号的调控。此外,SRPP基因启动子还具有热激响应元件(HSE)、干旱胁迫响应元件(MBS)、防卫和胁迫响应元件(TC-richrepeats)、脱落酸响应元件(ABRE)、赤霉素响应元件(GARE)和激发子响应元件(EIRE,Wbox)等,这表明橡胶树SRPP基因不仅参与调控橡胶生物合成,而且可能是橡胶树中响应逆境信号的抗性基因,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中发挥重要作用。     

玉米ZmMYB59基因启动子的克隆及功能分析

为研究ZmMYB59基因启动子的表达模式,以玉米自交系‘B73’幼苗基因组DNA为模板,克隆ZmMYB59基因2个启动子片段分别命名为MYB59-P-1、MYB59-P-2,构建GUS植物表达载体pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K,并通过农杆菌介导法转化水稻‘日本晴’获得GUS植物表达载体转基因植株。通过PlantCARE软件进行生物信息学分析,发现ZmMYB59基因启动子中具有ABRE和CCGTCC-box等重要的顺式作用元件。GUS染色结果显示:1)pCXGUS-MYB-1K的种子没有着色,表明其未驱动GUS在种子中表达,pCXGUS-MYB-2K的种子胚乳边缘着色,表明其驱动的GUS在种子胚乳边缘表达;2)种子萌发期pCXGUSMYB-1K只有芽尖着色,表明其仅驱动GUS在芽尖表达,pCXGUS-MYB-2K芽尖和根均着色,芽尖着色较深,根维管束细胞少量着色,表明其驱动的GUS主要在芽尖表达,而在根部维管束组织中表达较弱;3)苗期pCXGUSMYB-1K,pCXGUS-MYB-2K植株的根、茎、叶均能着色,但后者着色较深,表明ZmMYB59基因的启动子可能是组成型启动子,同时也说明MYB59-P-1是启动子发挥正常调控功能所必须的,但启动能力不强,推测MYB59-P-2中可能存在增强启动子表达的顺式作用元件。     

7，3＇，5＇-三取代黄烷酮和黄酮醇类化合物的合成

以3,5-二羟基苯甲酸和间苯二酚为原料,分别经酯化、乙酰化、甲氧甲氧基保护或甲基化、酰肼化、氧化、醛酮缩合、环化、Algar-Flynn-Oyamada反应以及脱保护基等步骤,以21%~32%的总收率合成了7,3’,5’-三取代黄烷酮1a~1b和黄酮醇类化合物2a~2b,所有合成产物通过1H NMR,IR,MS进行了结构确证.其中黄烷酮1b是从药用植物中间锦鸡儿Caragana intermedia Kang etH.C.Fu中分离得到的新天然有机化合物,此次为首次全合成.     

lncRNA 基因At3NC026490 启动子克隆与功能分析

lncRNAs是一类长度大于200 nt的非编码RNA,它们通过调控基因表达或直接影响蛋白功能,在植物生长发育与胁迫响应过程中发挥重要作用。At3NC026490是拟南芥中的一个lncRNA,目前尚未见该lncRNA功能方面的报道。从启动子角度对At3NC026490的功能进行探索,首先利用生物信息学手段分析At3NC026490启动子的特性,发现该启动子具有响应光、激素、胁迫等作用元件;随后构建At3NC026490启动子驱动GUS基因的表达载体并转入拟南芥中;GUS染色分析表明转基因株系的根、幼苗、叶等营养组织以及花器官的花瓣具有明显的GUS表型,而在不同发育时期的种子中并未观察到GUS表型,说明该启动子具有典型的组织驱动特性,表明At3NC026490基因可能在应答光、激素、胁迫刺激以及特定组织中发挥作用,该研究为后期深入阐释lncRNA的功能提供了重要信息和研究思路。     

玉米蔗糖合酶基因启动子的克隆及功能分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,Su Sy)是植物蔗糖代谢中的一类关键酶,在植物的生长发育过程中具有重要功能。以玉米自交系"B73"的基因组DNA为材料,通过PCR扩增出玉米蔗糖合酶基因SH1起始密码子上游1853 bp序列。生物信息学结果显示该序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件,参与干旱诱导的MYB结合位点,根、胚乳等器官表达响应元件。构建了由SH1启动子驱动报告基因Gus的植物表达载体,通过农杆菌介导法产生了水稻转化株系,Southern印迹结果显示获得了单拷贝的"中花11"转基因植株(PSH1)。组织化学分析和实时荧光定量PCR结果表明,Gus基因在根、茎、叶、叶鞘及颍壳中高效表达,但在花和种子中不表达。综上可知,SH1启动子是一个新颖的营养器官特异型启动子,在作物的品质改良中具有良好的应用前景。     

陆地棉Ghuhrf1基因及其启动子的克隆与功能分析

在分子育种过程中,优良基因和组织特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的重要因素之一。分析转录组数据库中差异基因表达谱发现,Ghuhrf1为开花当天胚珠优势表达基因,推测该基因可能参与或调控棉纤维的合成。根据其EST序列设计引物,通过RACE技术获得Ghuhrf1基因的全长cDNA序列。荧光定量PCR分析表明,Ghuhrf1在开花当天的胚珠中显著表达。通过同源序列分析获得Ghuhrf1的上游启动子Ghuhrf1 Pro。Ghuhrf1 Pro全长为1 417 bp,含有GC box、CAAT box、CAT box、CCGTCC box和ACGT motif等顺式作用元件和组织特异性调控元件。根据组织特异性调控元件的分布位置构建了4个不同程度的缺失体转化烟草和拟南芥进行分析。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子Pro和缺失体Pro1（-1 180～+226 bp）、Pro2(-867～+226 bp)、Pro3(-726～+226 bp)都能特异地驱动Gus基因在转基因拟南芥的叶片边缘尖部和莲座叶基部等分化生长旺盛部位表达,说明与分生组织表达相关的CAT box元件和CCGTCC box元件在启动子种子特异表达中起到重要的作用。同时,通过启动子缺失分析也表明,Ghuhrf1基因可能不是直接参与棉纤维的合成,而是间接的参与棉纤维原始细胞分化起始的调控。该结果为棉花纤维品质基因Ghuhrf1的功能研究提供了参考,并为棉花分子育种工程提供了新的调控元件。     

启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展*

 综述了启动子序列克隆和功能研究方法的研究进展。启动子克隆的主要方法有基因组文库筛选法、探针载体筛选法、常规PCR法、反向PCR法、锅柄PCR法、序列特异性引物PCR法、热不对称交错PCR法和Y型接头扩增法。其中,热不对称交错PCR法因操作简便、特异性较高而最有效。启动子功能分析方法有生物信息学分析法和实验分析法,前者主要依托数据库初步预测启动子序列;后者确定启动子的顺式元件及其功能,具体策略有点突变分析、凝胶阻滞分析、瞬间表达分析、转化分析和酵母单杂交分析。可为启动子功能的研究提供参考。     

石榴花类黄酮3′羟化酶基因的克隆及序列分析

为研究花色苷生物合成途径中类黄酮3′羟化酶基因(F3′H)的序列信息,以泰山红石榴花瓣为试材,提取总RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中登录的相关物种F3′H基因的保守序列设计兼并引物,对反转录后的cDNA进行PCR扩增并测序。结果表明:在石榴中克隆到了长度为996bp的F3′H基因cDNA片段,该基因编码331个氨基酸,含有细胞色素P450保守域,属于CYP75B亚家族。该序列在GenBank中的登录号为KC430328。     

枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。     

大豆种子特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从大豆中克隆得到β-伴球蛋白α亚基基因的启动子序列7αP,并对其进行功能分析。【方法】利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离β-伴球蛋白α亚基基因启动子序列7αP,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p7αP-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、Southern blot检测和GUS组织化学分析。【结果】序列分析表明,7αP长度为1 382 bp,其中含有多种种子特异性启动子的序列元件,如RY重复序列元件、E-box、SEF1-motif、SEF4-motif(、CA)n、Dc3启动子结合因子和ACGT序列元件及一些诱导物应答元件。转基因植株的PCR和Southern blot结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶等其他组织中均未检测到GUS活性。【结论】大豆β-伴球蛋白α亚基基因上游1 382 bp片段具有种子特异性启动子功能,7αP为种子特异性启动子。     

膜荚黄芪异黄酮3′-羟化酶基因的克隆及表达分析

异黄酮3′-羟化酶(Isoflavone 3′-hydroxylase,I3′H)是催化合成毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的关键酶.该研究从膜荚黄芪中克隆了I3′H基因cDNA全长,并对其进行了生物信息学分析,同时采用高效液相色谱法分别测定了毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量.结果表明:I3′H基因cDNA全长为18...     

金银花香豆酸3-羟化酶基因LjC3H2的生物信息学分析

香豆酸3-羟化酶广泛存在于植物中,属于细胞色素P450家族的CYP98A亚家族。该酶能在植物苯丙素代谢中催化苯环C3位置的羟基化反应,是绿原酸生物合成的关键酶之一。本文以金银花香豆酸3-羟化酶基因LjC3H2为研究对象,采用生物信息学方法进行分析。结果表明,LjC3H2无信号肽,无跨膜结构域,偏亲水,定位于内质网上;二级结构以α螺旋为主,无规则卷曲较多。LjC3H2与其他植物同源蛋白氨基酸序列比对和系统发育分析表明,LjC3H2与蓟、桔梗的C3H亲缘关系较近,与同属于金银花的LjC3H亲缘关系较远;该蛋白的三级结构与细胞色素P450三级结构相似。