灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型（菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等）和致病力进行分析。【结果】BcKMO编码犬尿氨酸单氧酶（kynurenine 3-monooxygenase,KMO）,含有单氧酶FAD的保守结构域和4个类似芳香环羟化酶（Aromatic-ring hydroxylase-like）的基序,与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的Rossmann卷曲NAD(P)(+)-结合蛋白（Rossmann-fold NAD(P)(+)-binding proteins,gi156049701）和从线嘴壳（Ophiostoma piceae）的FAD依赖性氧化还原酶（FAD-dependent oxidoreductase,gi512192943）同源性较高。成功构建了BcKMO的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP,利用PEG介导的转化方法,转化突变体BCG183的原生质体,获得了草胺膦抗性的转化子;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术鉴定转化子,获得了BcKMO的回复突变体BCG183/BcKMO。对突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型进行了分析,发现BCG183突变体的生长速率减慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝纤细;回复突变体和野生型菌株的生长速率、菌丝形态基本一致,均产生分生孢子和菌核。致病力分析发现,BCG183突变体在芸豆叶片和黄瓜叶片上的致病力均较野生型和回复突变体明显增强。【结论】灰葡萄孢BcKMO正调控病菌的生长、发育,负调控病菌的致病力。     

灰葡萄孢霉对不同葡萄品种致病力差异的检测和分析

为了探明适合中国葡萄灰霉病菌致病力检测的方法以及合适的待测葡萄品种,采用菌丝块接种法和改良的保湿培养法,分别测定3个不同致病力类型的灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)菌株SDXL7 1、SDLK1 1、LNXCetz6 1对红提、青提、巨峰、紫奶、玫瑰香5个葡萄品种的致病力,并进行差异分析。结果表明,供试菌株均可引起5种葡萄发病,但致病力不同的菌株所致的平均病斑面积有明显差异,同一菌株在不同葡萄品种上的平均病斑面积也有明显差异。其中,巨峰和青提对灰葡萄孢霉具有较强抗性,红提和玫瑰香对3个灰葡萄孢霉菌株普遍易感,紫奶对菌株LNXCetz6 1具有较强抗性,但对另外两个菌株易感。试验结果为系统和全面地研究中国灰葡萄孢霉菌株的致病力分化提供重要依据。     

灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO调控病菌致病力的机制分析

【目的】揭示灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO（kynurenine 3-monooxygenase）调控病菌致病力的机制,阐明灰葡萄孢致病的分子机理。【方法】利用DNS和Hoffman方法,对BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体（BCG183/BcKMO）的多聚半乳糖醛酸酶（PMG）、果胶酶（PG）、纤维素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）和果胶甲基反式消除酶（PMTE）的活性进行分析;提取灰葡萄孢野生型和BCG183、BCG183/BcKMO突变体的粗毒素并进行生物活性测定;利用溴百里酚蓝显色试验,对突变体BCG183和BCG183/BcKMO的产酸能力进行分析;利用洋葱表皮穿透试验,检测突变体BCG183和BCG183/BcKMO的穿透能力;利用real-time PCR技术,检测突变体BCG183和BCG183/BcKMO中已知致病相关基因腺苷酸环化酶编码基因Bac、异源三聚体G-蛋白G?亚基基因Bcg2和Bcg3、蛋白激酶调节亚基基因PkaR、MAP激酶编码基因Bmp1和Sak1、MAP激酶Bmp3和BcSak1下游的靶基因Bcreg1、TCHK-MAPK信号途径基因Bos1、亲环蛋白A编码基因Bcp1、小G蛋白基因Ras2、多聚半乳糖醛酸酶基因Bcpg1和超氧化物歧化酶基因Sod1的表达水平。【结果】突变体BCG183中的PMG和PG的酶活性较野生型和回复突变体明显增强,CX、PGTE和PMTE的酶活性与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183的毒素活性较野生型和回复突变体明显增强;突变体BCG183的产酸能力较野生型和回复突变体明显减弱;突变体BCG183能够穿透洋葱表皮,在培养基上形成菌落,与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183中已知致病相关基因Bac、Bcg2、Bcg3、PkaR、Bmp1、Sak1、Bcreg1、Bos1、Bcp1、Ras2、Bcpg1和Sod1的表达水平明显强于野生型和回复突变体。【结论】灰葡萄孢BcKMO通过调控病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、致病相关基因的表达而影响病菌的致病力。     

湖北省葡萄主产区灰葡萄孢菌多样性分析

【目的】了解湖北省葡萄主产区灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)多样性,为葡萄灰霉病防治提供科学依据。【方法】采用常规微生物分离法对从湖北省8个葡萄主产区采集的葡萄灰霉病样本进行灰葡萄孢菌分离,在PDA培养基上观察分离物菌落培养形态并测定菌丝生长速率;利用特异引物对各分离物的Flipper和Boty转座子片段进行扩增,区分转座子类型;扩增Bc-hch基因并用Hha I酶切检测分离物的多态性以区分组群;依据菌丝生长速率、菌落形态及转座子类型挑选4株典型分离物在4个葡萄品种果实上进行致病力测定。【结果】从病害样本中共分离获得51株分离物,菌落培养形态表明30株分离物为菌核型,20株为孢子型,仅1株为菌丝型,出现频率分别为58.82%、39.22%和1.96%。所有分离物菌丝生长速率均较高,在10.86~13.94 mm/d。分离物只存在2种转座子类型,其中50株为Transposa型,仅1株为Flipper型。Bc-hch基因Hha I酶切多态性鉴定结果表明,所有菌株均为Group II,为狭义的灰葡萄孢菌。分离物致病力测定结果表明,菌丝生长速率最低的WH3在供试葡萄品种上的致病力均最强,其次是Flipper型分离物SX1,菌丝生长速率最高的XN2和菌丝型WH6分离物致病力均较弱,且不同分离物在不同品种上致病力趋势不同。【结论】湖北省葡萄主产区灰葡萄孢菌菌落培养形态较丰富,所有分离物均为狭义灰葡萄孢菌,只存在Transposa和Flipper 2种转座子类型,前者占绝对优势,典型分离物间致病力差异明显。     

灰葡萄孢胞壁降解酶对番茄植株致病作用的分析

灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是一种寄主范围多达200多种植物的病菌,其在致病过程中能产生多种胞壁降解酶,包括多种果胶酶和纤维素酶。用果胶酶和纤维素酶处理番茄叶片,产生相似于病害症状的水渍状腐烂斑,能破坏细胞超微结构,使叶绿体、线粒体等细胞器解体;分生孢子萌发和菌丝生长中能产生多种酶类,其中多聚半乳糖醛酸甲基水解酶(PMG)活性较高,且分生孢子萌发60 h后该酶仍具有活性。在番茄植株不同部位形成的病斑中均能检测到PMG,病斑褐色部位的PMG活性明显高于黄色部位。纤维素酶活性除了在分生孢子萌发阶段和果实病斑中未能检出外,在菌丝培养液和叶片病斑的褐色部分均能检测到该酶活性。病菌果胶酶和纤维素酶活性与病菌致病力的相关性测验表明,两类酶与致病力均为正相关,相关系数分别为0.362 3和0.105 7。根据上述结果分析,果胶酶和纤维素酶均能对寄主植物造成伤害,在病菌致病过程中有增加病菌毒力的作用。     

灰葡萄孢菌核形成缺陷突变体的遗传分析

本研究通过筛选灰葡萄孢的ATMT突变体库,获得了1株不形成菌核,孢子产量明显减少,对番茄叶片的致病力明显增强的菌株BCt41。通过对该菌株进行PCR、Southern杂交鉴定,证明该菌株为遗传稳定的单拷贝T-DNA插入突变体。通过TAIL-PCR技术获得了T-DNA插入位点的侧翼序列,与灰葡萄孢数据库比对表明:T-DNA插入位点位于基因BC1G_02176.1的外显子2中。该基因编码区长1 206bp,含1个54bp内含子,编码383个氨基酸,基因功能未知。本研究结果为进一步研究该基因在灰葡萄孢分生孢子发育、菌核形成及致病过程中的作用奠定了基础。     

灰葡萄孢菌的诱变及其致病性研究

[目的]研究灰葡萄孢菌抗AbA(短梗霉素A)突变体的诱变方法与AbA对灰葡萄孢菌及其突变体细胞形态和致病力.[方法]以野生型灰葡萄孢菌为出发菌株,用不同浓度的EMS诱变和AbA筛选,获得抗AbA的突变菌株.[结果]AbA显著影响灰葡萄孢菌细胞形态,如孢子萌发延迟、芽管粗短、顶端分支增多、抑制菌丝生长,并且降低致病力.AbA对突变菌株细胞形态无影响,而对其致病力有一定的增强作用.[结论]确定了灰葡萄孢菌抗AbA突变体的诱变条件,证明了突变体能抵抗AbA对细胞形态和致病力的影响.     

灰葡萄孢产孢和孢子萌发条件

以灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株B05.10为试验材料,研究了培养基、温度、pH值以及某些营养因子对菌丝生长、产孢量和孢子萌发率的影响.结果表明,B05.10菌株在PSA培养基、pH 6.0,22℃培养7 d时产孢量最多达到1500×104 cfu/皿;在1水琼脂、pH 5.0,22℃条件下4 h时灰葡萄孢孢子开始出现萌发管,12 h时萌发管转变形成分枝的菌丝,添加木糖、果糖和可溶性淀粉等营养因子对提高孢子萌发率也有明显促进作用.     

与灰葡萄孢致病性相关的真菌毒素及胞外酶

植物病原菌灰葡萄孢引发的灰霉病能侵染大部分经济作物和观赏植物,是一种严重的植物病害。灰葡萄孢侵染植物使植物细胞死亡是一个复杂的过程,这个过程涉及了多种真菌毒素,胞外酶和其它小分子物质。概述与灰葡萄孢致病性相关的主要真菌毒素和胞外酶,并讨论他们作用机理,旨在为研究靶标性的抗灰霉真菌剂提供参考。     

灰葡萄孢分生孢子萌发的条件研究

灰葡萄孢分生孢子萌发的最适温度为 1 9℃ ,萌发率达 94 .3 %;在空气较多的环境中孢子萌发率较高 ,达87.8%,淹水则不利于孢子萌发 ,萌发率仅为 5.8%。 1 %蔗糖、1 %葡萄糖、1 %乳糖、1 %硫酸铵、0 .2 mol/ L磷酸二氢钾、番茄汁液都可以促进分生孢子萌发 ,以 1 %蔗糖效果最好。分生孢子在 p H3～ 9的条件下均可萌发 ,以 p H5最为适宜。孢子悬浮液在高浓度 ( 6× 1 0 5以上 )下会抑制孢子萌发 ,光照和黑暗处理对孢子的萌发影响不大     

大丽轮枝孢和灰葡萄孢生防放线菌的分离筛选

采用诱捕分离法从土壤中分离到28株放线菌,以大丽轮枝孢(Verticillium dahliae)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)作为靶标菌,通过皿内拮抗试验从中筛选出效果明显的SW6,SW9,SW16,SW20 4株生防菌株,其发酵原液对靶标菌的抑制效果明显高于发酵滤液和菌丝初提液。其中,菌株SW20的发酵液对2种靶标菌均有较强的抑制作用。抗药性测定结果表明,4株生防菌株对链霉素最为敏感,对供试杀菌剂抗性较强。     

我国灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)的新寄主植物

报道我国灰葡萄孢 (ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａＰｅｒｓ.:Ｆｒ.)的寄生性新寄主植物 73种 ,按寄主汉名、学名、分布地和标本号排列 ,标本保藏于云南农业大学真菌标本室 (ＭＨＹＡＵ) ,以供植保、植检部门参考。灰葡萄孢ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａＰｅｒｓ.:Ｆｒ.,Ｐｅｒｓｏｏｎ ,Ｓｙｎ .ｍｅｔｈ .Ｆｕｎｇ.ｐ .690 .1 80 1 .:Ｆｒ.,Ｓｙｓｔ.Ｍｙｃｏｌ.3 :396.1 832 .(≡ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒａｓｃｅｎｓＰｅｒｓ.,Ｒｏｅｍｅｒ’ｓＮｅｕｅｓＭａｇ.Ｂｏｔ.Ｉ:1 2 0 .1 794.)查氏培养基上菌落扩展迅速 ,2 0℃培养 1 0…     

重寄生放线菌F46和PR对灰葡萄孢的抑制作用

测定了2株重寄生放线菌对灰葡萄孢的作用效果。结果表明,重寄生放线菌F46(Streptomycessp.)和PR(Streptomycessp.)对灰葡萄孢分生孢子萌发和芽管伸长都有一定的抑制作用,镜检可以观察到F46和PR在灰葡萄孢菌丝上产生附着胞、缠绕靶标菌丝,使靶标菌丝畸形等现象;诱发接种后2株重寄生放线菌对苹果、草莓、番茄采后灰霉病均有不同程度的控制作用,在低温下的防效优于高温,提前诱发接种的防效优于同时接种。     

灰葡萄孢基因中微卫星序列分析

微卫星(SSR)一般是指由单、双、三、四、五和六核苷酸重复单元串联排列的简单重复序列,它广泛分布于生物基因组内,在不同生物中,微卫星DNA的数目、类型及其分布情况存在很大的差异.本研究主要统计了已公布的灰葡萄孢基因序列中的SSR数量及类型,在灰葡萄孢的564个预测基因区域中发现669个微卫星序列,其中大多数基因(477个基因)只含有1个碱基SSR,占含SSR基因总数的71.3％;72个基因含有2个碱基SSR,13个基因含有3个碱基SSR,含4个和5个碱基SSR的基因则各只有1个.所有SSR序列中,出现数量最多的为3个碱基和6个碱基的SSR序列,分别达到了135次和330次,1个碱基、2个碱基、4个碱基和5个碱基的SSR则分别出现了7、41、64和92次.SSR碱基数越多,重复的次数越少,重复次数最少的SSR是6个碱基的AGAGGG重复.重复次数最高的SSR为122次,是3个碱基的AAT重复,这表明,在选择压力下,SSR趋向于密码子的整数倍,这与其他物种的分析结果一致.发现大多数含有SSR的基因并没有明确的功能描述,这可能是由于这些基因受到SSR的影响而在进化上变化较快所致.     

拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性

为明确拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性,并筛选具有抗性的拟南芥材料,试验通过对拟南芥11个生态型进行接种试验,研究其对21个灰葡萄孢菌株的反应,结果发现,有10个灰葡萄孢菌株对拟南芥的11个生态型表现抗/感差异。其中Col-0、Ws-0和Ler生态型接种灰葡萄孢菌株BC18后表现典型的抗病和感病反应。组织病理学试验进一步确定了Col-0、Ws-0生态型为抗病生态型,而Ler为感病生态型,试验结果为进一步的植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定基础。     

灰葡萄孢分生孢子萌发的条件研究

灰葡萄孢分生孢子的最适温度为１９℃,萌发率达９４．３％,在空气较多的环境中孢子萌发率较高,达８７．８％,淹水则不利于孢子萌发,萌发率仅为５．８％,１％蔗糖,１％葡萄糖、１％乳糖,１％硫酸铵、０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾、番茄汁液都可以促进分生孢子萌发,以１％蔗糖效果最好,分生孢子在ｐＨ３￣９的条件下均可萌发,以ｐｈ５最为适宜,孢子悬浮液在高浓度下会抑制孢子萌发,光照和黑暗处理对孢子的萌发影响不大。     

灰葡萄孢菌两种发酵粗提物对烟蚜的杀虫活性初步研究

 用浸渍法测定灰葡萄孢菌的固体和液体发酵粗提物对烟蚜的触杀活性。结果表明：液体和固体的发酵产物对烟蚜都有杀虫活性，且固体发酵产物的触杀活性大于液体发酵产物，30 h后的LC₅₀分别为0.483 6 mg/mL和3.803 6 mg/mL。     

灰葡萄孢PKA编码基因在病菌生长发育和致病过程中的功能

为明确灰葡萄孢cAMP信号途径中蛋白激酶A的催化亚基基因pka1、pka2和调节亚基基因pkaR在病菌生长、发育和致病过程中的功能,本研究构建了灰葡萄孢pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体,以野生型菌株BC22为对照,对pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体的表型和致病力进行分析,发现pka1基因的RNAi突变体的生长速率明显减慢、菌丝细胞变短、分生孢子产量增加、致病力减弱,菌落颜色、形态以及穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pka2基因RNAi突变体的菌丝较野生型明显变细,分生孢子产量降低,生长速率、致病力和穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pkaR基因RNAi突变体的菌丝变细,生长速率减慢,分生孢子产量降低,致病力减弱,穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别。结果表明:灰葡萄孢pka1基因正调控病菌的生长、菌丝发育和致病力,负调控分生孢子的形成;pka2基因正调控病菌的菌丝发育和分生孢子的形成;pkaR基因正调控病菌的生长、菌丝发育、分生孢子的形成和病菌的致病力。     

灰葡萄孢致病基因BcPDR1与Gα亚基基因的关系研究

为了探究灰葡萄孢致病基因BcPDR1与病菌G蛋白α亚基基因之间的关系,利用qRT-PCR技术分析BcPDR1基因突变对Gα亚基基因BcBCG2和BcBCG3表达的影响以及BcBCG2、BcBCG3基因突变对BcPDR1基因表达的影响;在敲除突变体ΔBcpdr1的基础上,构建BcBCG2、BcBCG3基因过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE,对过表达菌株的表型和致病力进行分析。结果发现,BcPDR1基因的缺失突变体中BcBCG2、BcBCG3基因的表达水平显著升高,BcBCG2、BcBCG3基因沉默突变体中的BcPDR1基因的表达水平显著降低;BcBCG2、BcBCG3基因的过表达菌株的菌落形态、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与野生型BC22菌株基本一致,而与ΔBcpdr1突变体存在显著差异。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1与Gα亚基基因BcBCG2、BcBCG3之间密切相关,BcPDR1负调控BcBCG2、BcBCG3基因的表达,BcBCG2、BcBCG3正调控BcPDR1基因的表达。研究结果为阐明灰葡萄孢致病基因BcPDR1调控病菌生长发育和致病力的机制奠定了基础。     

灰葡萄孢及其毒素的生物活性测定

用对峙培养法和生长速率法分别测定灰葡萄孢及其毒素对植物病原真菌的抑菌活性 ;用抑菌圈法测定毒素对植物病原细菌的抑菌活性 ;用浸渍法测定毒素的杀虫活性 ;以种子幼根幼芽生长抑制率为活性指标 ,测定毒素对杂草种子发芽力的抑制活性及对农作物种子发芽势的影响 ;在杂草出苗后喷施毒素 ,测定毒素对杂草幼苗的杀伤活性和对出苗后农作物生长的影响。结果发现 ,3d内灰葡萄孢毒素对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑制率达 5 6 %以上 ;1d内毒素对马铃薯环腐病原细菌的抑菌圈直径为 6 mm,对白菜软腐病原细菌的抑菌圈直径为 9m m;毒素原液对黏虫、小菜蛾和菜青虫的杀伤活性很小 ,对反枝苋和牵牛花等双子叶杂草幼苗的杀伤活性达 10 0 % ,对禾本科作物和杂草苗后生长影响很小。毒素对单子叶杂草和双子叶杂草的种子发芽均有抑制作用 ,对禾本科作物种子发芽也有一定影响。