茄子Ⅳ型查尔酮异构酶基因SmCHI2的克隆与分析

【目的】探究茄子花青素合成通路中关键酶SmCHI2的蛋白特性和表达特性，为完善茄子花青素生物合成途径和品质育种提供一定的理论基础。【方法】通过同源克隆获得茄子SmCHI2基因全长序列，利用在线分析工具对其蛋白理化性质进行预测，利用ClustalX 1.7、GeneDoc 2.7.0和Mega 6.0软件进行蛋白序列比对和系统进化树分析，利用qRT-PCR分析SmCHI2基因的表达模式。【结果】SmCHI2基因编码区全长633 bp,编码210个氨基酸。蛋白理化性质分析显示SmCHI2蛋白分子量为23.98 kDa,理论等电点为4.81,且为不稳定的亲水性蛋白。二级和三级结构预测显示SmCHI2蛋白结构主要包括α-螺旋、随机卷曲、延伸链和β-转角。多序列比对表明SmCHI2与LcCHI(枸杞AIC33515.1)、LrCHI(黑枸杞AQZ26680.1)、CaCHI2(辣椒XP＿016573438.1)和StCHI3(马铃薯XP＿006365329.1)等Ⅳ型CHI蛋白具有相同的活性和识别位点，且在系统进化树中属于同一分支。亚细胞定位结果显示，SmCHI2蛋白在细胞核、细胞膜和细胞质中均...     

成年克隆猪与正常繁殖猪心脏的比较蛋白质组学研究

【目的】探讨体细胞核移植(即克隆)操作对克隆猪心脏发育的影响。【方法】分别对3头正常繁殖猪和3头成年克隆猪的心脏进行解剖学观察和组织切片分析。提取心脏蛋白样品,利用基于双向电泳-质谱体系的比较蛋白质组学技术对心脏蛋白进行分析。【结果】解剖学观察和组织切片分析证实,克隆猪心脏发育异常;与正常繁殖猪相比,克隆猪心脏蛋白共有6种差异表达蛋白,分别为组织蛋白酶-D、骨骼肌型α-肌动蛋白、心肌肌球蛋白重链、热休克蛋白-27、Telethonin和骨骼肌型α-肌动蛋白,其中前5种蛋白表达上调,后1种蛋白表达下调。【结论】一些重要的心脏蛋白表达异常可能导致了克隆猪的心脏发育缺陷,比较蛋白质组学手段可以作为探索体细胞核移植机制的重要方法。     

意大利蜜蜂Ci蛋白的生物信息学分析

【目的】掌握意大利蜜蜂转录因子(Ci)的生物信息学并阐述其功能,为揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信号通路中的功能和作用打下基础。【方法】从NCBI获取意大利蜜蜂Ci蛋白氨基酸序列,分别使用ProtParam预测其理化性质、SignalP-5.0预测信号肽、TMHMM-2.0预测跨膜结构,通过NetOGlyc 3.0、NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1、SUMOplot等进行O-糖基化位点、N-糖基化位点、磷酸化位点及苏木化位点预测,采用GOR4、SWISS-MODEL、CD-Search等预测意大利蜜蜂Ci蛋白高级结构,在多重序列比对分析的基础上利用MEGA 11.0构建系统发育进化树,并通过String数据库预测相互作用蛋白。【结果】意大利蜜蜂Ci蛋白存在2个亚型,分别是XP＿624136.4和XP＿006558245.2。其中,XP＿624136.4亚型的开放阅读(ORF)为4338 bp,编码1445个氨基酸残基,编码蛋白分子量为15.50 kD,理论等电点(pI)为8.39;XP＿006558245.2亚型的ORF为3873 bp,编码1290个氨基酸残基,编码蛋白...     

4种天然产物对福寿螺肝脏和头足酶活性的影响

【目的】寻找防治福寿螺的天然杀螺剂并初步探寻其作用机制。【方法】以福寿螺死亡率，肝功能和头足运动能力相关酶活性为综合评价指标测定槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸4种天然产物对福寿螺的毒杀活性，并在此基础上优选出活性最佳的化合物进行RT-qPCR结果验证。【结果】槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸对福寿螺24 h的校正死亡率分别为45.0%、27.3%、23.5%和12.0%；与空白组相比，福寿螺肝脏中的ALT/GPT酶活性分别降低了72.9%、58.9%、66.8%和66.5%，肝脏中AST/GOT酶活性分别升高115.5%、103.8%、70.5%和88.2%；福寿螺头足中AChE活性分别下降43.9%、29.6%、24.8%和42.2%,NOS活性分别下降55.9%、38.8%、37.9%和30.2%。研究发现，槲皮素的杀螺效果最好，并进一步对其进行RT-qPCR测定。在槲皮素胁迫下，福寿螺肝脏中SOD和CAT的mRNA表达量以及头足中SOD的mRNA表达量显著升高，肝脏中IDH的mRNA表达量和头足中TM的mRNA表达量显著下降（P<0.05）。【结论】槲皮素通过影响福寿螺肝...     

小鼠胚胎诱导型Hsp70基因的RNA干扰有效序列筛选

 【目的】应用RNA干扰技术沉默小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中诱导型热休克蛋白70（Hsp72）基因的表达,从而筛选出对Hsp72基因具有确实干扰作用的siRNA。【方法】设计并合成4对特异性针对Hsp72基因的siRNA,借助LipofectamineTM 2000瞬时转染MEF,41℃热应激处理后,采用RT-PCR和Western blot检测Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量。【结果】在热应激组中,siRNA1、siRNA2两组及阳性、阴性和空白3个对照组的Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量均极显著高于常温对照组（P＜0.01）,siRNA3和siRNA4两组的Hsp70 mRNA的表达量极显著低于常温对照组（P＜0.01）;siRNA3组Hsp70蛋白表达量极显著低于常温对照组（P＜0.01）,而siRNA 4组与常温对照组差异不显著（P＞0.05）。与空白对照相比,4对siRNA中siRNA3和siRNA4对MEF中Hsp72 mRNA有极显著（P＜0.01）的抑制作用,其对Hsp72 mRNA的抑制率分别为86.2%和75.4%（P＜0.01）,对Hsp72蛋白表达的抑制率分别为77.3%和57.0%（P＜0.01）。【结论】体外合成的四对特异性针对Hsp72基因的siRNA中,靶位点在Hsp72 mRNA二级结构表面位置的siRNA3和siRNA4对Hsp72基因具有显著的抑制作用,靶位点在Hsp72 mRNA二级结构复杂处的siRNA1和siRNA2对Hsp72基因的抑制作用不明显。     

基于 TMT和PRM 技术筛选番茄响应盐胁迫差异表达蛋白

【目的】 盐胁迫是造成番茄产量损失和品质严重下降的关键非生物胁迫之一,研究番茄耐盐的分子机制,为认识番茄幼苗应答盐胁迫分子调控机制奠定基础。【方法】 研究利用番茄耐盐渐渗系IL-7-5-5和番茄盐敏感M82为试材,采用同位素相对标记与绝对定量(TMT)技术结合定量蛋白质组平行反应监测(PRM)技术,对200 mM盐胁迫12 h的番茄幼苗叶片进行蛋白质组学研究,筛选出盐胁迫响应显著的潜在靶标蛋白。【结果】 (1)共鉴定出286个差异显著表达蛋白(DEPs)。盐胁迫下IL-7-5-5鉴定到191个DEPs,其中119个表达上调,72个表达下调。在M82中鉴定出157个DEPs,其 中84个表达上调,73个表达下调。维恩图分析显示,有129和95个差异蛋白分别特异于IL-7-5-5和M82。有62个显著差异蛋白共表达,其中 28 个在IL-7-5-5和M82中均上调,15 个均为下调,表现出对盐胁迫的一致响应。19个显著差异蛋白在表达相反,有5个蛋白质在ST中下调,在SS中上调,14个差异蛋白在ST中上调,在SS中下调;(2)番茄盐反应蛋白种类诱导能力强,主要与代谢过程、单组织过程以及细胞过程有关,细胞组成主要涉及细胞、细胞器、分子复合物和膜,基因本体分子功能显示,这些差异性蛋白主要参与催化活性、绑定和分子功能调控。(3)选择11个显著差异蛋白PRM验证结果与TMT 定量表现出相同的趋势。差异蛋白包括 A0A3Q7E8T9、A0A3Q7EK65、A0A3Q7FY19、A0A3Q7G430、A0A3Q7ITH0、A0A3Q7J1Y7、P05116、Q43779、A0A3Q7F8W6、A0A3Q7GKU3、A0A3Q7J0Z4,可能是番茄幼苗耐盐的潜在靶标蛋白。【结论】 研究采用 TMT 结合 PRM 技术,筛选出番茄幼苗响应盐胁迫差异表达蛋白。     

干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响

【目的】探究乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase α,ACACA)对猪原代肌肉卫星细胞（muscle satellite cells,MSCs）增殖凋亡以及成脂转分化的影响。【方法】通过体外培养MSCs模拟猪肌内脂肪的形成过程，根据ACACA基因序列构建3条小干扰RNA，采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰MSCs内ACACA的表达后，分别通过q RT-PCR、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、油红O染色和检测甘油三酯（TG）等方法对MSCs增殖、凋亡以及转分化时期脂滴形成效果进行评估。【结果】在增殖期干扰ACACA,MSCs内细胞周期标志基因Cyclin D1(P<0.05)、Cyclin E(P<0.000 1)以及抗凋亡基因BCL-2(P<0.05)的表达量下调，促凋亡基因BAX(P<0.05)的表达量上调；在对MSCs进行成脂转分化诱导作用下，MSCs具有向脂肪细胞转分化的能力，而干扰ACACA后，MSCs中脂滴极显著减少（P<0.000 1）。【结论】干扰ACAC...     

大肠杆菌多重耐药株与敏感株蛋白质组差异分析

【目的】研究临床分离的大肠杆菌多重耐药株(R)与大肠杆菌标准株ATCC 25922(S)蛋白质差异表达情况,为进一步研究大肠杆菌耐药机理奠定基础。【方法】采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)法结合平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术,对大肠杆菌R和S株的全菌体蛋白进行定量蛋白质组学研究,筛选大肠杆菌多重耐药株(S)与敏感株(R)之间的差异表达蛋白,并对其生物信息学进行分析。【结果】共筛选出300个差异表达蛋白(Fold change≥1.3,P0.05),其中上调167个,下调133个,涉及的耐药相关通路主要包括细菌趋药性、ABC转运蛋白、β-内酰胺抗性等;PRM成功定量到13个差异蛋白,且PRM验证结果与TMT定量结果一致。【结论】筛选出多个与大肠杆菌耐药性相关的差异表达蛋白和通路。     

受棉铃虫诱导的棉花糖基转移酶UGT基因家族的生物信息学及表达分析

【目的】筛选分析受棉铃虫诱导的棉花糖基转移酶(Glycosyltransferase)UGT基因家族，为UGTG01、UGTG02、UGTGo4、UGTGo6、UGTGo7基因功能深入研究奠定基础。【方法】以受棉铃虫诱导筛选出的棉花糖基转移酶UGT基因组数据库为基础，利用生物信息学方法分析棉花糖基转移酶UGT基因家族的理化性质、系统进化树、蛋白质的二级结构预测以及保守基序与结构域。【结果】从棉花基因组中搜索到5个推定的UTG基因家族成员，其氨基酸数目介于468～534个，理论等电点分布在4.97～5.58,相对分子质量区域为52 743.1～60 208.62,亚细胞定位在细胞质外，均为亲水性蛋白质。基因结构均含有1个外显子，二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲为主，均含3个Motif基序和有Glycosyltransferase＿GTB-type superfamily结构域。5个基因在根、茎、子叶、真叶、花、棉桃中具有明显的组织表达差异性，5个基因与UGT73C家族基因，水稻的UGT707A3、大豆的GmUGT在进化树的同一分支上。【结论】糖基转移酶基因在不同组织中的表达具有显著差异...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的差异蛋白

【目的】研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染MARC-145细胞生长相关蛋白表达量的变化,明确差异蛋白的功能信息,为深入研究PRRSV病毒复制和致病机理奠定基础。【方法】采用差异蛋白质组学和Western blotting技术,通过建立双向凝胶电泳,对高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后表达量差异蛋白质进行了胶内酶解、质谱分析鉴定及数据库检索,明确差异蛋白质的相关信息。【结果】得到7个表达稳定、重复性好的蛋白点,其中有5个蛋白点找到匹配蛋白,分别为热休克蛋白70、硫氧还蛋白、S100钙结合蛋白A6、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白,其余2个蛋白点为未知蛋白。在MARC-145细胞感染PRRSV后,热休克蛋白70和S100钙结合蛋白A6表现为下调,而硫氧还蛋白、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白表现为上调。功能预测分析发现,5个蛋白与MARC-145细胞抗应激、抗氧化、生长、凋亡和信号转导等作用息息相关。【结论】高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后,能诱导细胞部分功能蛋白表达量的增加或减少。     

NMRAL1对流感病毒复制的调控机制

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05) (H5N1)和A/WSN/33 (H1N1) 两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。     

蛋白质组学在番茄非生物逆境胁迫中的研究进展

【目的】回顾近年来蛋白质组学在番茄逆境胁迫中的研究进展,综述蛋白质组学技术在番茄响应非生物(盐碱、干旱、高温、低温、其它)胁迫上的研究进展,为利用蛋白质组学技术进一步研究番茄响应非生物逆境胁迫的分子机制奠定理论基础。【方法】运用统计学方法收集文献资料,并分析汇总蛋白质组学技术在番茄响应非生物(盐碱、干旱、高温、低温等)胁迫的研究文献进展情况。【结果】盐胁迫耐受性(渗透调节,渗透保护,离子稳态,消除氧清除剂,胁迫反应等)与胁迫的持续时间有关;下调的蛋白主要参与代谢和能量转换,上调的蛋白参与信号转导或运输;干旱应答蛋白包括与耐热性和渗透性保护剂的产生、脂质代谢、细胞壁修饰、神经酰胺代谢和丝裂原活化蛋白磷酸化相关的蛋白;蛋白质广泛参与了细胞过程,包括防御/应激反应,离子结合/转运,光合作用和蛋白质合成;最初如何感知胁迫条件,以及植物器官激活了哪些主要反应,可以避免低温胁迫晚期相关蛋白的干扰。【结论】在非生物逆境胁迫条件下,番茄通过改变自身的蛋白质表达水平对各种非生物胁迫作出响应。蛋白质组学研究能够全面揭示番茄响应胁迫时其细胞内蛋白质的动态变化规律,鉴定差异表达的蛋白质,是番茄抗逆生物学研究的重要组成部分。     

螺虫乙酯抑制西花蓟马卵孵化的蛋白质组学分析

【目的】前期研究发现,螺虫乙酯处理西花蓟马(Frankliniella occidentalis)0 h卵24 h后,造成卵壳破裂从而抑制卵孵化出若虫。本研究旨在探究螺虫乙酯处理西花蓟马0 h卵24 h后引起卵形态结构发生变化的原因,寻找螺虫乙酯抑制西花蓟马0 h卵孵化的关键蛋白,揭示螺虫乙酯抑制西花蓟马卵孵化的分子机制。【方法】以西花蓟马0 h卵为研究对象,使用浓度为14.42 mg·L^-1的螺虫乙酯处理24 h后,采用无标记定量(Label-free)蛋白质组学技术分析螺虫乙酯处理组与对照组之间的差异表达蛋白。利用Gene Ontology(GO)富集分析和KEGG通路分析对筛选出的差异表达蛋白进行功能注释和通路分析等生物信息学分析,并通过平行反应监测(PRM)技术验证差异蛋白的表达量。【结果】螺虫乙酯处理后共有204个蛋白差异表达,其中124个蛋白表达量上调,80个蛋白表达量下调。生物信息学分析表明,上调的差异表达蛋白主要参与物质合成和代谢通路,下调的差异表达蛋白主要参与对外界刺激的防御反应通路。此外,利用PRM技术对差异表达蛋白进行鉴定,结果表明螺虫乙酯处...     

Krüppel-Like Factor 3（KLF3）基因对牛脂肪沉积的作用

【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3 基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇合度时转染筛选得到的KLF3基因SiRNA和阴性对照SiRNA（NC）,并进行诱导分化培养至第0天和第4 天时,利用荧光定量PCR方法研究分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins α, C/EBPα）,脂肪酸代谢关键基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase α, ACCα）和脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）基因在牛脂肪细胞分化不同时期干扰KLF3基因处理组和对照组之间表达量的变化,同时在干扰KLF3基因处理并进行诱导脂肪细胞分化的第 4天采用油红O染色法观察干扰KLF3基因处理组和对照组之间脂滴差异及采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定甘油三酯含量进一步确定KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用。【结果】KLF3-Si2 具有最高的干扰效率达到73%。转染KLF3-Si2后PPARγ的表达量在牛脂肪细胞诱导分化的第0天 和第4 天与对照组相比分别下调了58% 和37%,达到了差异极显著（P<0.01）,C/EBPα 的表达量也分别下调了64% 和41%,达到了差异极显著（P<0.01）。脂质代谢的关键基因FABP4的表达量与对照组相比在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4 天分别下调了89% 和60%,而ACCα的表达量干扰KLF3处理组与对照组相比在脂肪细胞诱导分化第0天和第4天分别下调了50% 和37%, 而FAS的表达量则分别下调了73% 和19%,都分别达到了差异极显著（P<0.01）。在牛脂肪细胞诱导分化第4天油红O染色和甘油三酯含量测定也发现干扰KLF3基因处理组与对照组相比脂滴减少,甘油三酯含量显著下降（P<0.05）。【结论】干扰牛KLF3基因可以抑制牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢关键基因表达量下调,进而影响脂肪的沉积。     

ChREBP基因siRNA表达质粒构建及对原代 培养猪脂肪细胞生脂的影响

【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。     

baeR基因对沙门菌耐药相关蛋白表达及耐药基因的调控作用

【目的】探究baeR对鼠伤寒沙门菌耐药相关蛋白表达水平的影响以及对耐药基因的调控作用,为鼠伤寒沙门菌耐药性的深入研究提供理论依据。【方法】采用非标记定量蛋白质组学技术，以差异倍数（FC）≥1.5且P<0.05为标准，筛选鼠伤寒沙门菌baeR和acrB双缺失CR株（鼠伤寒沙门菌ATCC13311体外诱导环丙沙星耐药株）(C1)、baeR过表达C1株(CA)和baeR回补株(CM)的差异表达蛋白，对筛选的差异蛋白进行GO富集和KEGG通路富集分析，探究差异蛋白的主要功能和涉及的生物过程；采用平行反应监测（PRM）蛋白质组学技术对筛选到的抗药相关差异蛋白CysP、GltI、ArgT、MdtA、OmpF、ArcA、FrdD、DcuB、TorR、UhpA、NarZ、PgtA、MraY、CheM、CheA、Trg进行验证；采用LacZ报告基因融合实验研究baeR对靶基因pmrF和mdtC的调控作用。【结果】CA/C1比较组中共筛选到393个差异蛋白，其中上调182个，下调211个；CM/C1 比较组中共筛选到391个差异蛋白，其中上调202个，下调189个。差异表达蛋白主要集中在外排泵、外膜蛋白、生物膜、生物合成、双组分系统等通路。PRM验证结果定量到CysP、GltI、ArgT、OmpF、ArcA、DcuB、TorR、PgtA、CheM、CheA、Trg等11个蛋白，其表达水平变化趋势与非标记定量结果一致，证实了蛋白质组结果的可靠性。baeR可以正向调控pmrF和mdtC的表达。【结论】明确了baeR过表达对鼠伤寒沙门菌耐药相关蛋白水平的影响及对相关耐药基因的调控作用。     

牛Nanog基因真核表达载体构建及有效干扰序列筛选

 【目的】构建牛Nanog基因的真核表达载体pVenus-Nanog,筛选对其有效的干扰序列。【方法】以含有牛Nanog基因的PMD-18T-Nanog重组质粒为模板,经PCR扩增目的片段,将其克隆到真核表达载体pVenus上,酶切及测序鉴定正确后命名为pVenus-Nanog。将pVenus-Nanog用脂质体瞬时转染牛皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting分别检测Nanog的表达情况。针对牛Nanog基因的CDS区设计并合成3对干扰序列,分别命名为S1、S2、S3及阴性对照N.C.,用脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA于成纤维细胞,用半定量RT-PCR分析干扰效率。【结果】酶切分析与测序结果表明重组载体pVenus-Nanog构建成功,荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting结果显示其能够在牛成纤维细胞中高效表达。脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA后,半定量RT- PCR结果显示S1效果最好,干扰效率达75%,S2和S3分别为20%和70%。【结论】成功构建了牛Nanog真核表达载体pVenus-Nanog,且获高效表达。通过脂质体共转染法筛选出了牛Nanog基因的有效干扰序列,为研究该基因在胚胎干细胞及早期胚胎中维持多能性调控网络中的作用机制奠定了基础。     

siRNA干扰ATGL基因表达对猪脂肪细胞脂肪分解的抑制作用

【目的】探讨猪脂肪甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)基因在脂肪细胞脂解中的作用。【方法】构建针对猪ATGL基因CDS区113和1 358位点的慢病毒干扰载体,包装后用其感染猪成熟脂肪细胞,检测ATGL和激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase,HSL)基因mRNA及其蛋白的表达情况;用甘油试剂盒检测细胞甘油释放量。【结果】成功构建了ATGL基因的慢病毒干扰载体,用其感染猪成熟脂肪细胞后,RT-PCR分析和Western印迹检测结果表明,试验组脂肪细胞ATGL的表达显著下调,HSL的表达没有明显变化;甘油释放量显著降低,其中针对ATGL基因CDS区113位点的siRNA1对ATGL mRNA的干扰效率达55%,甘油释放量降低了49%。【结论】成功构建了猪ATGL基因慢病毒干扰载体,其能显著降低ATGL基因mRNA及其蛋白在猪成熟脂肪细胞中的表达,降低脂肪细胞的甘油释放量,表明ATGL在猪脂肪细胞脂解中有着重要作用,且113位点是ATGL基因CDS区的最佳干扰靶位点。     

烟草种子成熟过程的蛋白组学研究

【目的】研究烟草种子成熟过程的蛋白变化规律,筛选与烟草种子成熟相关的标记蛋白。【方法】以同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)为基础,研究烟草种子成熟过程蛋白组的变化。【结果】从不同成熟度烟草种子中鉴定出14 316个肽段、2852个蛋白,其中1973个蛋白至少包含2个特征肽段,占总蛋白数的69.18%。在授粉后21～27 d随着烟草种子发育进程差异表达蛋白数量逐渐增多,在27～31 d趋于稳定,在31～33 d差异表达蛋白数量迅速回落,变化趋势与发芽率变化趋势一致。筛选出4个差异蛋白,他们在种子发育前期表达量不断上升并在适熟时期(授粉后第31 d)表达量达到最高,随后表达量急剧下降。【结论】烟草种子发育过程不同阶段差异蛋白功能的响应不同,早期主要是执行种子形成的结构功能,中期主要负责种子生命活动的生化反应,后期主要维持遗传物质的动态平衡和稳定。筛选出的成熟度相关蛋白经进一步确认后可单独或组合起来作为指示种子成熟度和质量的分子标记。     

纳米铜对大鼠肝脏毒性相关蛋白过氧化氢酶的分离鉴定及生物信息学分析

【目的】分离和鉴定纳米铜对大鼠肝脏毒性相关蛋白过氧化氢酶(catalase, CAT),探讨CAT在毒性发挥中的作用,为揭示纳米铜对肝脏毒性机制提供依据。【方法】应用2-DE技术和PDQuest 8.0软件在大鼠肝脏蛋白组中筛选纳米铜对肝脏毒性差异蛋白,经质谱鉴定后进行生物信息学分析。【结果】筛选到下调的差异蛋白点6602和7702与肝毒性相关,鉴定均为CAT蛋白;其性质稳定,有一定亲水性,无信号肽,定位于细胞质,可能属于非分泌性蛋白,含有过氧化氢酶活性位点64FDRERIPERVVHAKGAG80和过氧化氢酶亚铁血红素配合基位点354RLFAYPDTH362等功能位点;无规则卷曲、α螺旋和延伸链是其主要的二级结构元件,并预测了其三级结构图;同源性分析表明,大鼠的CAT与其它8个物种有较高同源性,并构建了CAT 蛋白的系统进化树。【结论】纳米铜通过下调大鼠肝脏中CAT蛋白表达,引起肝细胞氧化应激损伤,可能是其发挥毒性作用的途径之一。