生物钟基因调控牦牛睾酮分泌的机制研究

【目的】研究生物钟基因调控牦牛睾酮分泌的分子机制，为生物钟靶向调控牦牛繁殖力提供理论依据。【方法】于清晨08:00左右（ZT0）和下午20:00左右（ZT12）采集雄性牦牛的血液和睾丸，用ELISA检测牦牛血清睾酮含量是否存在昼夜节律性表达；用IHC法检测生物钟蛋白Bmal1在睾丸中的表达定位；采用普通PCR法检测生物钟基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）在牦牛睾丸中的表达；采用实时荧光定量PCR法检测生物钟基因、类固醇合成基因(StAR、Hsd3b1、Hsd17b3、Cyp11a1）和核受体基因（Sf1、Nr4a1、Lhcgr、Nr0b1）在牦牛睾丸中的时空表达规律；用蛋白免疫印迹（WB）检测生物钟蛋白Bmal1和类固醇合成蛋白StAR在牦牛睾丸中的表达变化；用生物信息学预测牦牛睾酮合成相关因子启动子区域生物钟作用元件。【结果】牦牛体内睾酮含量存在昼夜节律性表达，ZT0时的含量极显著低于ZT12（P＜0.001）；生物钟蛋白Bmal1在牦牛睾丸中存在节律性表达，主要分布在睾丸间质细胞中；4个生物钟基因、类固醇合成基因Hsd17b3和Cyp11a1及核受体基因Nr4a1、Lhcgr和Nr0b1在牦牛睾丸中均存在节律性表达；类固醇合成蛋白StAR在牦牛睾丸中有表达，但无节律性；牦牛类固醇合成相关基因启动子区域存在与生物钟基因结合的E-box、RORE和D-box元件。【结论】牦牛睾丸生物钟基因通过调控类固醇合成相关基因的表达，影响睾酮的分泌水平。     

家蚕蜕皮激素合成相关的细胞色素P450基因的鉴定分析

【目的】昆虫变态发育的启动主要受前胸腺合成分泌的蜕皮激素所调控,而蜕皮激素的合成是由细胞色素P450基因催化完成。家蚕（Bombyx mori）是一种产丝昆虫,蚕业生产中如果能阻断或延迟家蚕蛹变态发育进程,将有利于改进蚕茧处理工艺,提高蚕丝品质。论文旨在鉴定参与家蚕蜕皮激素合成的细胞色素P450基因,从而为人为遗传调节家蚕变态发育提供靶基因。【方法】基于序列同源性比对,筛选家蚕及其他昆虫中参与蜕皮激素合成的P450基因。利用ClustalW软件,分析昆虫蜕皮激素合成相关P450基因的遗传发生关系。通过全基因组表达芯片数据分析及RT-PCR验证,调查家蚕蜕皮激素合成相关P450基因的时空表达特征。利用RNAi技术分析Cyp314a1表达下调对家蚕变态发育的影响。【结果】家蚕基因组中有4个参与家蚕蜕皮激素合成的P450基因,即Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1和Cyp314a1。比较分析显示,这4个蜕皮激素合成相关的P450基因在家蚕及其他昆虫中都是单拷贝,而且每个基因的同源体在遗传发生树上能很好地聚成一类,表明昆虫蜕皮激素合成相关的P450基因及其负责的蜕皮激素合成通路非常保守。时空表达谱分析显示,在家蚕幼虫5龄第3天,Cyp302a1、Cyp315a1和Cyp314a1主要在家蚕幼虫卵巢、精巢和头部等组织器官中高表达;在幼虫-蛹-成虫变态发育进程中,Cyp302a1、Cyp315a1和Cyp314a1主要在蛹变态发育后期表达,其中Cyp314a1分别在上簇、化蛹及羽化前高表达,这与蜕皮激素滴度高峰出现的时期基本一致。Cyp314a1的RNAi导致家蚕不能正常化蛹及雌蛾卵巢发育异常,且降低了蜕皮激素信号通路关键基因HR3及Ftz-f1的表达。【结论】家蚕蜕皮激素合成相关的P450基因在进化上非常保守,其表达水平降低能引起家蚕蛹变态发育受阻,暗示蜕皮激素合成相关P450基因可以用作家蚕变态发育控制的靶标基因之一。     

白斑狗鱼StAR基因克隆及其表达分析

【目的】克隆白斑狗鱼（Esox lucius）类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）基因（ElStAR）并分析其组织表达差异,为开展StAR基因生物学功能研究及揭示白斑狗鱼性腺发育机制提供基础资料。【方法】根据GenBank已公布的白斑狗鱼基因组测序结果（NC_047581.1）设计特异性引物,采用RT-PCR克隆ElStAR基因cDNA序列,通过ClustalX、ExPASy、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和SignalP 5.0等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR进行ElStAR基因组织表达定量分析。【结果】ElStAR基因cDNA序列长度1485 bp,其开放阅读框（ORF）为864 bp,共编码287个氨基酸残基;ElStAR氨基酸序列与北极红点鲑StAR氨基酸序列的相似性最高（93.33%）,与海鳟、条纹鲈鱼、金头鲷、大菱鲆、斑马鱼、半滑舌鳎的相似性均高于75.00%,而与小家鼠的相似性最低（59.15%）;基于StAR氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示白斑狗鱼与北极红点鲑和海鳟等鲑科鱼类处于同一分支。ElStAR蛋白相对分子量为32.23 kD,理论等电点（pI）为8.98,为不稳定的亲水性蛋白;具有START结构域,无信号肽及跨膜结构,符合线粒体靶向肽的基本特征。ElStAR蛋白二级结构由α-螺旋（占40.77%）、无规则卷曲（占35.89%）、延伸链（占18.12%）和β-折叠（占5.23%）组成,其三级结构是由α-螺旋配合多个β-折叠卷曲盘旋而成。ElStAR基因在白斑狗鱼精巢、卵巢、头肾、肝脏、肌肉及脑组织中均有不同程度的表达,且在精巢中的相对表达量极显著高于在卵巢中的相对表达量（P<0.01）,呈明显的性别二态性表达模式。【结论】ElStAR基因编码蛋白结构和功能十分保守,具有典型的START结构域,对胆固醇的运输和调节起重要作用。ElStAR基因在白斑狗鱼精巢及卵巢中的表达存在极显著差异,可能在维持白斑狗鱼精巢的发育形成中发挥重要作用。     

高羊茅FaFKF1基因克隆、亚细胞定位及节律表达分析

【目的】克隆高羊茅蓝光受体家族基因（FaFKF1）,分析其序列特征及亚细胞定位,并检测其在不同光照处理下的节律表达特征,为探索其在成花中的调控机制及高羊茅光周期适应性育种提供理论依据。【方法】采用RACE方法克隆FaFKF1基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测FaFKF1基因不同光照处理和不同生长阶段的节律表达特征。【结果】克隆获得FaFKF1基因cDNA全长为2266 bp,开放阅读框（ORF）为1881 bp,编码626个氨基酸残基,蛋白分子量为68.89 kD,理论等电点（pI）为5.76,脂肪系数为80.99,不稳定指数为39.81,属于较稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞核。FaFKF1蛋白的二级结构包含α-螺旋（24.92%）,无规则卷曲（44.89%）、延伸链（23.16%）和β-转角（7.03%）。FaFKF1蛋白与大豆（NP_001235886.2）、大麦（KAE8795993.1）和二穗短柄草（XP_003577479.1）的氨基酸序列相似性较高,为79.50%~87.68%,且与二穗短柄草FKF1蛋白的亲缘关系最近,其次是大麦和小麦。长日照处理下,FaFKF1基因在苗期、分蘖期、孕穗期和抽穗期的叶片中均有表达,相对表达量变化趋势也较相似,均在ZT8时（即下午16:00）达最高峰,呈现出24 h的昼夜节律,但在孕穗期和抽穗期的相对表达量明显较高。在长日照和短日照基础上施加不同光照处理下,FaFKF1基因均能通过自身调节来适应环境的变化,虽然表达峰出现时间不一致,但整体上能维持24 h的昼夜节律。【结论】FaFKF1基因在细胞核发挥作用,且在不同光照下均呈现节律表达,受光周期的诱导调控。     

基于转录组测序筛选影响从江香猪产仔数的候选基因

【目的】筛选出影响从江香猪产仔性状的基因调控网络,揭示其繁殖分子机理,为后期开展从江香猪繁殖性能研究及良种选育提供理论依据。【方法】以高产仔家系（平均产仔数≥12头,遗传稳定）和低产仔家系（平均产仔数8～10头,遗传稳定）从江香猪为研究对象,选择初情期不同产仔家系从江香猪卵巢组织各3个,使用Illumina HiSeqTM 2000测序仪进行转录组测序（RNA-Seq）,并对筛选获得的差异表达基因进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析,以寻找与从江香猪产仔数相关的基因调控网络。【结果】从高产仔家系和低产仔家系从江香猪卵巢组织中测序获得的纯净序列（Clean reads）均超过5000万条,且有96.00%以上的Clean reads能比对上猪参考基因组。以|log₂FC|≥1.0且P<0.01为标准,筛选获得高产仔家系和低产仔家系从江香猪卵巢组织差异表达基因212个,其中上调表达基因138个、下调表达基因74个。采用实时荧光定量PCR对随机选择的10个差异表达基因进行定量分析,发现OSAP、MSMB、FGFBP1、RLN、HAS1和PLBD1基因在高产仔家系从江香猪卵巢中的相对表达量显著高于低产仔家系从江香猪（P<0.05,下同）,而EDG7、PTX3、BSP1和MRO基因在低产仔家系从江香猪卵巢中的相对表达量显著高于高产仔家系从江香猪,与RNA-Seq测序结果一致。212个差异表达基因共富集在48个GO功能条目上,包含分子功能（Molecular function）、生物学过程（Biological process）和细胞组分（Cellular component）;经KEGG信号通路分析发现共有70个差异表达基因注释到特定的代谢信号通路上,其中显著性富集的KEGG信号通路有类固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、卵巢类固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）、心肌细胞肾上腺信号通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）和肥厚型心肌病通路（Hypertrophic cardiomyopathy,HCM）。在卵巢类固醇生成通路上发现SCARB1、STAR、COX2、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A等7个基因与从江香猪的繁殖性能存在密切联系。【结论】从江香猪卵巢类固醇生成通路上的STAR、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A基因与其发情排卵密切相关,于发情期上调表达能促进卵泡发育成熟及类固醇激素合成,通过增加排卵数量而促使从江香猪表现高产,故可作为从江香猪繁殖性状的候选基因。     

牦牛MPC1和MPC2基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】明确牦牛线粒体丙酮酸载体编码基因（MPC1和MPC2）的分子生物学特性及其组织表达特征,为揭示MPC基因在牦牛适应高原环境和能量代谢中的作用机制提供理论依据。【方法】选取麦洼牦牛为研究对象,PCR扩增牦牛MPC1和MPC2基因编码区（CDS）序列,利用在线生物信息学分析软件预测其蛋白结构及理化性质,并以实时荧光定量PCR检测MPC1和MPC2基因在不同年龄（0.5、1.5和2.5岁）牦牛各组织中的表达情况。【结果】牦牛MPC1基因CDS序列长330 bp,共编码109个氨基酸残基;MPC2基因CDS序列长384 bp,共编码127个氨基酸残基。基于MPC1和MPC2基因CDS序列相似性构建的系统发育进化树显示,牦牛分别与黄牛和水牛的亲缘关系最近,与绵羊的亲缘关系最远。牦牛MPC1和MPC2蛋白均为稳定的亲水性蛋白,丙氨酸和亮氨酸含量较高,有跨膜结构但无信号肽,均存在1个MPC结构域;其二级结构以α-螺旋为主（分别占57.80%和55.12%）,三级结构模型为5xpd.1.A。MPC1和MPC2基因在2.5、1.5和0.5岁牦牛心脏中的相对表达量均最高,其次是肾脏和肝脏,而在脾脏...     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

雌性三角帆蚌Srd5a1基因的分子鉴定和功能研究

性类固醇激素与生物生殖、配子排放以及性腺发育密切相关,Srd5a1在性类固醇激素合成过程中扮演重要角色。为了探究性类固醇激素合成相关酶基因Srd5a1对雌性三角帆蚌卵巢发育的影响,本实验应用RACE克隆得到了三角帆蚌Srd5a1全长cDNA序列,通过实时荧光定量（qRT-PCR）、原位杂交技术以及不同浓度17β-雌二醇（E2）和17α-甲基睾酮（MT）激素处理来探究Srd5a1的表达特性。结果显示,Srd5a1 cDNA全长2224 bp,包括446 bp 5′-UTR,953 bp 3′-UTR,825 bp ORF,编码274个氨基酸。Srd5a1在性腺中的表达呈二态性,在卵巢中表达量更高;Srd5a1在卵巢排放期的表达量最高,极显著高于其他各时期（p ＜0.01）。原位杂交结果显示,Srd5a1在卵巢卵母细胞、卵泡以及精巢精母细胞中有表达。不同浓度E2和MT处理24天后,Srd5a1的表达发生了变化。综上,Srd5a1可能在雌性三角帆蚌卵巢卵母细胞发育成熟和配子排放中发挥一定作用,对探索三角帆蚌性腺生长发育具有重要意义,同时为实现三角帆蚌单性化养殖提供理论参考价值。     

三个牦牛群体激素敏感脂肪酶（HSL）基因外显子Ⅰ的多态性

 【目的】探究激素敏感脂肪酶（HSL）基因在牦牛内的遗传多态性,为进一步揭示牦牛群体间遗传分化、开展牦牛肉质性状的关联分析以及HSL基因在牦牛物种中的定位、表达调控等研究提供依据。【方法】采用PCR-RFLP方法对九龙牦牛、麦洼牦牛和巴州牦牛共92头牦牛的HSL基因部分外显子I进行SmaI酶切多态性分析;统计基因频率、基因型频率大小,进行卡方（χ2）适合性、独立性检验,并计算纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量等遗传多态参数。【结果】3个牦牛群体在HSL基因外显子I具有SmaI酶切多态性,在该酶切位点存在AA、AB和BB 3种基因型。3个牦牛群体均检测到AA和AB基因型,而BB基因型只在巴州牦牛中检测到。九龙牦牛和麦洼牦牛的AA基因型频率最高,而巴州牦牛AB基因型频率最高;A等位基因频率在3个牦牛群体中均高于B等位基因频率,为优势等位基因。适合性检验表明3个牦牛群体在该酶切位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态;独立性检验表明九龙牦牛与麦洼牦牛、巴州牦牛之间表现为差异显著（0.01＜P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）,而麦洼牦牛与巴州牦牛之间表现为差异不显著（P＞0.05）。测序分析表明,HSL基因外显子I第70位（从PCR产物测序片段的5′端计数）发生了单碱基突变（G→A）,并导致了编码氨基酸由甘氨酸（G）变为精氨酸（R）。【结论】牦牛在HSL基因外显子I内具有SmaI酶切多态性,其多态性是因所分析序列内一单碱基突变（G→A）所致,该碱基转换导致了氨基酸由甘氨酸（G）变为精氨酸（R）;在该酶切位点,九龙牦牛、麦洼牦牛和巴州牦牛均处于Hardy-Weinberg平衡状态。九龙牦牛与麦洼牦牛、巴州牦牛之间表现为差异显著（0.01＜P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）,而麦洼牦牛与巴州牦牛之间表现为差异不显著（P＞0.05）。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase,HSL）基因在牦牛中的遗传多态性,进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性,同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据,寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在3种基因型;②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余多态位点均偏离;③测序分析表明,H-FABP基因外显子4第7 339位（与原序列相比）发生单碱基突变（T→C）,该突变属同义突变;HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换,以及第6816处发生碱基A→G突变,并导致编码氨基酸由天冬氨酸（D）转变为甘氨酸（G）;外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变,编码氨基酸由半胱氨酸（C）变为甘氨酸（G）;④对各标记基因型生长发育指标（体高、体斜长、胸围、管围、体重）进行差异显著性检验,仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著（P﹤0.01）。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性,且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

天祝白牦牛LF基因克隆及分子特征

 【目的】哺乳动物乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等方面起着重要作用。本试验对天祝白牦牛乳铁蛋白基因的编码区进行克隆和分子特征分析。【方法】以处于干乳期的天祝白牦牛乳腺组织为材料,通过RT-PCR克隆了包含LF基因编码区的cDNA序列（GenBank收录号为EU547252）;将克隆获得的天祝白牦牛LF基因的cDNA与奶牛相应序列进行比对;对天祝白牦牛LF蛋白（GenBank收录号为ACB29795）与其它物种LF蛋白进行序列比对和进化树分析;对牦牛LF蛋白的特性和结构进行预测。【结果】克隆获得天祝白牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124 bp,编码708个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与奶牛该序列存在15个碱基的变异,其中位于LF基因编码区的变异有12个,这些突变造成4个氨基酸变异;天祝白牦牛LF蛋白与奶牛、人、小鼠、山羊、绵羊、猪、狗、马、骆驼、猩猩、鸡LF蛋白氨基酸相似度分别为99.4%、69.5%、63.5%、92.4%、91.5%、72.9%、69.1%、72.6%、75.3%、69.5%和50.9%;各物种LF蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由1段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈“二枚银杏叶型”结构。【结论】从天祝白牦牛克隆获得LF基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛LF蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。     

麦洼牦牛Toll样受体1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆并分析高原牦牛Toll样受体1基因(TLR1)的特点。【方法】提取麦洼牦牛脾脏RNA,反转录合成cDNA,以其为模板分段扩增后拼接获得麦洼牦牛TLR1基因编码区序列,采用相关分析软件对基因进行序列分析,并对其编码的蛋白质进行基本理化性质分析及预测。【结果】分段扩增获得了TLR1基因1 484bp的上游序列和823bp的下游序列,拼接后获得2 287bp的cDNA序列。TLR1基因系统进化树及同源性比对结果表明,TLR1基因极其保守,牦牛TLR1基因与黄牛、绵羊等哺乳动物遗传距离很近。预测TLR1基因含有1个2 184bp的开放阅读框,编码727个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为83.148 7ku;预测TLR1蛋白在第500~600位氨基酸区域含有1个疏水区域,结合跨膜区预测认为该疏水区域可能是TLR1蛋白的一个跨膜区,TLR1蛋白二级结构主要以α-螺旋及自由卷曲为主。【结论】TLR1基因在高原牦牛与平原哺乳动物之间存在较高的同源性,这可能与TLR1蛋白重要的生理功能相关。     

牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其 在睾丸组织中的表达水平

【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt7基因cDNA序列一致,包含一个长度为1 113 bp的开放阅读框,编码370个氨基酸,具有完整的DM功能域,二级结构主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主。在牦牛各组织器官中,Dmrt7基因mRNA仅在睾丸组织中特异性表达。牦牛睾丸组织中Dmrt7mRNA和蛋白的表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA和蛋白表达水平明显高于犏牛,且Dmrt7蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。     

菊花节律钟输出基因CmGI（GIGANTEA）的cDNA全长克隆、序列信息及定量表达分析

【目的】克隆菊花节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列,进行序列信息学分析,研究其mRNA的相对定量表达。【方法】利用多聚酶链式反应（PCR）结合5′RACE、3′RACE技术,克隆节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析;通过在线建模软件对蛋白质的三维结构进行建模预测;利用实时荧光定量PCR技术,用2-△△Ct法进行GIGANTEA的mRNA相对定量表达分析。【结果】从菊花品种‘Jinba’中克隆得到节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列,核苷酸序列长度3 461 bp,开放阅读框3 453 bp,编码1 150个氨基酸。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白与植物节律钟输出基因GIGANTEA同源,命名为CmGI基因,序列提交到GenBank,登录号为JQ043439。序列比对显示与葡萄、蓖麻等的GI的相似度依次为76%、75%。构建类似蛋白系统进化树显示,菊花CmGI与拟南芥（Arabidopsis thaliana GIGANTEA,ABP96482.1）分子进化距离最近,其次是白菜（Brassica rapa GIGANTEA,AEB33730.1）;预测CmGI蛋白有6个跨膜螺旋多次跨膜;为转录因子,定位在细胞核中,为非分泌性蛋白质;不具备信号肽;对CmGI三级结构建模预测表明,蛋白核心结构符合转录因子与DNA结合常见的功能域HTH、HLH;采用荧光相对定量分析,菊花CmGI的表达呈昼夜节律表达模式;不同花芽分化阶段叶片中CmGI基因mRNA水平差异大,两个高峰值分别出现在花芽分化启动期和小花原基分化中期;营养生长的组培苗、长日照条件下的叶、芽、花蕾期均是痕量表达;盛花期表达量依次为叶片>舌状花>筒状花。【结论】从菊花中克隆得到节律钟输出基因CmGI,对该基因的进一步深入研究有助于探索光周期途径菊花成花的分子调控机制,可作为切花菊花期调控分子育种的目标基因。     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定

【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标。【方法】以pMD19-T-Secda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到Secda2a基因。构建原核表达载体pET-28a-Secda2a,IPTG诱导蛋白表达。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建重组转座载体pFastBac HT A-Secda2a,脂质体转染昆虫细胞Sf9,Western blot对SeCDA2a重组蛋白进行分析,以对硝基苯胺为底物利用分光光度计测定其酶活力。【结果】Secda2a在大肠杆菌和Sf9中均成功表达61kDa的重组蛋白,与预测分子量大小相符。IPTG终浓度为0.50mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高。昆虫细胞Sf9表达的重组蛋白SeCDA2a的酶活力是1.57U/mL。【结论】本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达,测定重组蛋白SeCDA2a的酶活力。     

白菜生物钟相关基因BrPRR7的克隆及表达模式分析

白菜生物钟基因的识别及多拷贝间的分析将有助于解析多倍化基因组带来的更复杂生物钟调控机理。本研究通过同源克隆方法获得了位于大白菜A10染色体的BrPRR7a基因。生物信息学分析表明,该基因和位于A02染色体的另一个拷贝BrPRR7b基因的DNA序列主要差异存在于5’UTR和启动子区域。蛋白进化分析表明,BrPRR7a和BrPRR7b之间以及相对于拟南芥已经产生分化。烟草亚细胞定位结果显示,GFP-BrPRR7a融合蛋白的绿色荧光信号定位于细胞核,支持其作为转录因子的负调控能力。4个转录组数据集的分析表明,在BrPRR7基因对光暗导引和温度循环导引后的内源昼夜节律性方面,BrPRR7a比BrPRR7b到达转录高峰更早,且BrPRR7a比BrPRR7b的最大转录水平更高;BrPRR7a和BrPRR7b基因在轻度干旱处理下的最大转录水平有少量的上升,暗示了它们在干旱胁迫状态下对植物生命活动进行微调的潜在作用。综合以上结果,推测BrPRR7a和BrPRR7b基因在白菜中均保留了拟南芥生物钟AtPRR7基因的部分功能,此外,也具有潜在的进化出新功能的可能性。该研究为白菜生物钟基因的功能及分子调控机制研究奠定了一定的基础。