菠萝黑心病研究进展

本文综述菠萝黑心病的发病症状，发病机理等有关方面的研究现状及进展；同时，结合菠 萝生产和保鲜过程听实际情况，提出控制菠萝黑心病的可能途径。     

菠萝AcPLD2基因多克隆抗体制备及其在果实黑心病发生中的表达分析

菠萝是中国最具有特色和竞争优势的热带水果之一,但采后菠萝果实不耐贮藏,极易发生黑心病,严重影响果实品质和商品率,而且威胁菠萝产业的健康发展.因此减少采后菠萝损失直接关系到热区农民的经济收入.黑心病是采后菠萝果实一种常见的生理性病害,由于该病的生理机制尚不清楚,所以国内外尚未有完全控制黑心病发生的方法.目前关于菠萝黑心病...     

采后菠萝黑心病发病过程中活性氧的代谢途径

为了探讨采后菠萝黑心病发病过程中活性氧的代谢途径,以‘巴厘’菠萝为材料,将其贮藏在25 ℃条件下,观察黑心病的发病情况,每隔3 d对整果果肉以及健康部位和患病部位的果肉组织进行取样,测定果实发病率以及果肉褐变度,对发病过程中脂氧合酶（LOX）活性和丙二醛（MDA）含量进行了测定,同时对活性氧代谢起关键作用的抗坏血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、类黄酮含量以及活性氧清除相关酶（POD、CAT、SOD）活性进行了测定。结果表明,菠萝果实在贮藏第6天开始发病,到15 d时,发病率为100%,褐变度在第6~9天时增长最快;在黑心病发病过程中,与健康部位相比,患病组织伴随着LOX活性的升高,MDA的积累,同时出现AsA的下降、类黄酮含量的显著增加,且患病组织POD、CAT酶活性快速下降,但谷胱甘肽含量和SOD酶活性几乎没有变化。由此可推断,在采后菠萝黑心病发病过程中,AsA、类黄酮、POD、CAT在活性氧代谢中起关键作用。     

包装对菠萝黑心病和品质的影响

以国内主栽品种巴厘的夏季果为试材,研究不同包装材料对菠萝黑心病及相关品质指标的影响。结果表明:0.02 mm聚乙烯、0.03 mm聚氯乙烯、0.05 mm聚氯乙烯包装均可降低贮藏菠萝的失重率,减少黑心病的发生率。贮藏15 d时,不同包装菠萝的可溶性固形物、维生素C、可滴定酸、可溶性蛋白含量无显著差异,但0.05 mm聚氯乙烯薄膜包装可维持可溶性总糖含量,因此,0.05 mm聚氯乙烯包装菠萝能更好地保持其品质。     

外源抗坏血酸处理对采后菠萝黑心病发生和果实品质的影响

为了探明抗坏血酸对菠萝果实采后保鲜的有效性,本研究以“巴厘”菠萝（Ananas comosus cv. Comtede Paris） 为材料,分别用 0.2%和 0.4%（质量体积百分比 w/V）的抗坏血酸（L-Ascorbic acid,AsA）浸泡处理,以清水浸泡为 对照,0.02 mm 厚聚乙烯打孔薄膜袋包装后,于常温(25±2)℃、相对湿度 85%~95%的水果储藏库中贮藏,观察采后菠 萝黑心病发生与果实品质的变化。结果表明：AsA 处理有效地延缓菠萝黑心病的发生,保持菠萝果实的硬度,抑制可 滴定酸、可溶性固形物和维生素 C 含量的减少,在贮藏后期能够有效地抑制丙二醛（MDA）的积累。果肉氧化酶活性 测定结果表明,0.2% AsA 处理可抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）活性增加,保持较高的过氧化物酶 （peroxidase,POD）活性。可见,AsA 能够有效地延缓菠萝黑心病的发生,保持采后菠萝的食用品质,抑制采后菠萝 果实酚类物质酶促氧化的发生,延缓菠萝贮藏期间的衰老进程,并且 0.2% AsA 的处理效果优于 0.4% AsA 的处理效果, 因此 0.2% AsA 为最佳处理浓度。     

香蕉抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)是植物重要的过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)清除酶之一。通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为MaAPX2基因。MaAPX2基因是香蕉APX基因编码框全长cDNA,包含一个750 bp的最大开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),编码249个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列结构域比对发现,在MaAPX2 N端具有典型的APX活性位点(APLMLPLAWHSA)和过氧化物酶近端血红素配体序列(DIVALSGGHTL)的保守结构域,属于典型的APX蛋白。系统进化树比对分析表明,MaAPX2与马蹄莲ZaAPX(AAC08576.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaAPX2基因组成型表达于香蕉各个组织,在叶片中表达量最大。在耐病和感病品种中,MaAPX2基因均上调表达,但在耐病品种中MaAPX2基因在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。MaAPX2基因可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

菠萝AcHMGR基因的克隆与表达分析

以菠萝(Ananas comosus L.cv.Comte de Paris)果实为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(命名为AcHMGR)的c DNA及基因组DNA全长。AcHMGR的c DNA全长2 407 bp,其开放读码框长度为1 740 bp,编码579个氨基酸;其基因组DNA全长为4 115 bp,从起始密码子到终止密码子的长度为3 764 bp,含有4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR结果表明,对照的菠萝果实中,AcHMGR基因表达量在花后0 d最高,从花后30 d开始,其表达量急剧下降,之后维持在一个较低水平直到果实成熟。经20 mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(CPPU)处理后,显著提高了AcHMGR基因在花后30 d果实中的相对表达量,为同期对照的1.8倍;但其他时期的相对表达量与对照相比无明显差异。研究结果表明,AcHMGR基因在菠萝果实早期发育过程中表达量较高,CPPU处理提高了AcHMGR基因的相对表达量并显著提高果实的重量,说明CPPU处理后AcHMGR基因可能在促进果实重量的增加中起着重要作用。     

橄榄多酚氧化酶基因(PPO)克隆及其试管苗离体保存过程中的表达分析

以来源于橄榄成熟胚的橄榄试管苗为材料,进行PPO基因克隆,比较试管苗不同保存阶段PPO基因转录水平和PPO酶活性的变化。结果表明:克隆获得1个PPO基因全长cDNA序列,命名为PPO2,GenBank登录号为JQ319005,cDNA全长序列为1 934 bp,推测出橄榄PPO开放阅读框(ORF)1 818 bp,编码606个氨基酸。橄榄PPO2属于碱性、亲水、非分泌蛋白,可能定位于线粒体基质空间,具有3个典型的保守结构域,丝氨酸磷酸化占主导地位,并且二级结构以不规则卷曲为主。而三级结构预测表明,橄榄试管苗PPO2蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲组成;进化树分析显示橄榄PPO蛋白与胡杨PPO关系最近,而与葡萄和莲的亲缘关系较远;qPCR分析显示,PPO2基因在橄榄试管苗不同保存阶段都有表达,但在橄榄试管苗保存1个月幼叶比较多时PPO2基因的表达量最高;而橄榄试管苗在分别保存1、2、3、4、5个月时PPO活性变化趋势不明显,当保存时间到6、7、8个月时PPO活性急剧增加。因此,PPO基因可能与幼嫩组织的启动分化有关,并在橄榄试管苗生长发育过程中发挥重要作用。     

氯化钙处理对菠萝黑腐病的防控效果及机制分析

为了降低采后菠萝果实由黑腐病引起的腐烂损失,本文研究了氯化钙处理对黑腐病的防控效果及相关机制。结果表明,1%氯化钙处理对菠萝黑腐病有最好的抑制作用和防治效果。1%氯化钙处理对病菌菌丝生长影响不大,但可明显抑制病原菌的产孢;氯化钙处理明显降低发病果实中多聚半乳糖醛酸甲酯酶（PMG）、纤维素酶（CX）和β-葡萄糖苷酶（CB）的活性,但对多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性变化没有明显影响;氯化钙处理明显提高贮藏中后期菠萝果实中过氧化氢（H₂O₂）的含量,明显提高抗病相关酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、几丁质酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）的活性。说明氯化钙处理对黑腐病有较好的防控效果,一方面是由于其降低了病原菌的致病性,另一方面是诱导菠萝果实提高了抗病性。因此,适宜浓度的氯化钙处理为菠萝采后黑腐病的绿色防控提供了一条新的途径。     

菠萝COL基因的克隆及响应乙烯的表达特性分析

COL(CONSTANS Like)基因不仅响应光周期调控,还参与植物器官的发育及非生物胁迫的响应.本研究克隆了4个菠萝COL(AcCOL)同源基因,预测其蛋白的结构理化性质和启动子顺式作用元件,并探究AcCOL基因在乙烯利处理后的时空表达模式.结果表明:AcCOL1、AcCOL2基因分别编码387、243个氨基酸,都...     

茶树体胚APX基因克隆及其在体胚发生过程中的表达与酶活性分析

以铁观音茶树体胚为材料,克隆了茶树抗坏血酸过氧化物酶基因CsAPX(Genbank登录号为MG799534.1)。CsAPX基因包含一个长度为753 bp的开放阅读框(ORF),共编码250个氨基酸,并对其进行相关生物信息学分析。APX酶活性测定结果表明在球形胚至子叶胚阶段APX酶活性呈现下降趋势,并在子叶胚阶段到达最低值,随着体胚进一步的分化,在子叶胚、成熟胚和萌发胚阶段,茶树APX酶活性不断上升,总体呈"先降后升"的趋势。在体胚发生过程中CsAPX基因的表达分析显示,CsAPX基因在茶树体胚发生的5个阶段均存在显著差异表达,总体呈"升—降—升"的趋势,其中在萌发胚阶段的CsAPX基因的表达水平显著高于其他4个阶段,推测CsAPX基因在体胚发生过程中的萌发胚阶段发挥着重要的作用。     

菠萝MYB基因AcoMYB1的克隆与表达分析

根据菠萝转录组的测序结果克隆到1个MYB转录因子基因,命名为AcoMYB1,GenBank登录号为XM₀20230319。该基因cDNA全长1221 bp,开放阅读框(ORF)为747 bp,编码一个含有248个氨基酸的蛋白。序列分析表明,AcoMYB1氨基酸序列N端具有2个保守的SANT结构域,属于R2R3类MYB转录因子。生物信息学分析表明,AcoMYB1是不稳定的亲水蛋白,不具有跨膜结构和信号肽,可能定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。实时荧光定量PCR分析表明,AcoMYB1在菠萝干旱、低温逆境胁迫处理下受诱导表达,整体上表现出"先升后降"的趋势;在早熟品种和晚熟品种的果实发育过程中也被诱导表达,表现为"升-降-升"的趋势,特别是在果实发育早期和果实成熟后期受诱导表达的强度较为突出。由此推测AcoMYB1作为正调控因子参与菠萝冷害、干旱逆境胁迫的响应过程,并在菠萝果实早期发育及后期成熟发挥调控作用。     

青稞CHS基因的克隆及原核表达分析

为进一步研究查尔酮合酶（Chalcone synthase,CHS）在黄酮化合物代谢过程中的作用,以青稞94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHS基因,并对分离得到的CHS基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHS基因编码区长为1 197 bp,编码398个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为43.479 kDa,预测等电点(pI)为5.92,是酸性蛋白;该酶蛋白体外红细胞中的半衰期为30 h,不稳定系数(II)大于40,属于不稳定蛋白;平均亲水指数为-0.090,是亲水性的蛋白。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并在大肠杆菌BL21中表达,可得到64 kDa左右的融合蛋白,在IPTG诱导浓度为1.0 mmol·L^-1时,最佳诱导时间为3 h。     

低温下冬小麦SOD及APX酶相关基因的表达分析

为进一步揭示寒地冬小麦抗寒的生理机制,以抗寒性差异较大的"东农冬麦1号"和"中国春"为材料,测定不同低温冷冻条件下小麦超氧化物歧化酶(SOD)相关基因TSOD-1、TSOD-2、TSOD-3以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)相关基因HAPX-1、HAPX-2、HAPX-3的表达差异。结果表明,TSOD-1、TSOD-2、TSOD-3、HAPX-2和HAPX-3基因在特定低温条件下于东农冬麦1号中的表达量明显高于中国春,而HAPX-1基因在东农冬麦1号中的表达量几乎均低于中国春。其中,TSOD-3基因在冻处理初期(低温驯化30d及-10℃2h)于东农冬麦1号中的表达量相对于中国春达到最大,分别是中国春中的8.63和11.78倍;HAPX-2和HAPX-3基因均在冷冻期(-12℃2h)于东农冬麦1号中的表达量相对于中国春达到最大,分别是中国春中的3.12和21.22倍。因此,初步推断TSOD-3、HAPX-2和HAPX-3基因是参与低温响应的重要基因。其中,TSOD-3基因在冷胁迫初期起主要作用,HAPX-2和HAPX-3基因在持续冷冻下起主要作用。     

菠萝酸性转化酶基因家族初步生物信息学及表达分析

酸性转化酶（acid invertase, AIN）在菠萝采后蔗糖降解过程中起着重要作用,基于菠萝全基因组数据库,预测菠萝AIN家族基因并进行生物信息学分析,解析其在采后菠萝不同贮藏温度下的表达变化情况,为阐明AIN基因在采后菠萝果实贮藏特性中的作用奠定基础。以水稻AIN家族基因为探针,在菠萝全基因组中鉴定到2个菠萝细胞壁酸性转化酶基因（cell wall acid invertase, CWIN）和2个液泡酸性转化酶基因（vacuolar acid invertase, VIN）,分别命名为AcCWIN1、AcCWIN2、AcVIN1、AcVIN2,设计编码区引物进行测序验证,并进行生物信息学分析。进化分析结果表明,AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2蛋白分别归于细胞壁酸性转化酶和液泡酸性转化酶2个进化支上,且均属于糖基水解酶家族GH32,基因结构、保守域和保守基序均一致。荧光定量分析结果表明,菠萝果肉中AcVIN1和AcVIN2在果实采后贮藏过程中表达量升高,且AcVIN1在发生黑心病的部位大量表达,而AcCWIN1和AcCWIN2在采后贮藏过程中表达量逐渐降低,且随着贮藏温度的升高其表达量降低,预示AcVIN1、AcVIN2较AcCWIN1、AcCWIN2在菠萝采后蔗糖降解和黑心病的发生方面发挥着更为重要的作用。     

菠萝贮藏过程中香气成分的变化

采用顶空固相微萃取技术,研究巴厘菠萝果实贮藏过程中香气成分的组成及变化。结果表明,巴厘菠萝果实贮藏过程中主要香气成分是酯类,且含量随贮藏时间的延长增加。己酸甲酯是主要的酯类成分,在贮藏过程中含量也随时间的延长而增加。巴厘菠萝在果实贮藏期间,各香气成分的相对含量变化较大。     

苋菜试管开花过程中相关microRNA表达的qPCR分析

以苋菜无菌试管苗及其试管开花过程中各阶段培养物为材料,利用qPCR技术进行苋菜试管开花过程相关microRNA的表达分析。研究结果表明:由NormFinder软件计算出最适合的内参基因为ama-miR159a;在苋菜试管开花过程中,ama-miR156c、ama-miR156d、ama-miR156g相对表达量在幼苗期向壮苗期转变过程中呈下降趋势,并在整个发育过程中一直保持较低水平;ama-miR156h、ama-miR157b、ama-miR157c、ama-miR157d、ama-miR3和ama-miR10相对表达量在幼苗期向花芽期转变过程中呈下降趋势,并在花芽期达到最低;ama-miR172d的表达模式与miR156/miR157表达模式相反;苋菜试管苗幼苗期到花芽期形成时ama-miR319b相对表达量呈上升趋势,ama-miR164b在花芽期时相对表达量比较高,花芽期向开花期转变时,其相对表达量降低;ama-miR166a/miR166g表达在苋菜开花过程中始终呈上调表达;ama-miR167b/miR167d和ama-miR4相对表达量先略有升高然后降低,在花芽期降到最低,随后又升高。由此可见,microRNA在调控苋菜试管苗由幼苗期向壮苗期转变、营养生长向生殖生长转变以及花器官的形成等过程中起重要的调控作用。     

菠萝NAC转录因子基因AcoNAC1生物信息学及表达分析

NAC转录因子作为植物中数量最大的转录因子家族之一,在植物生长发育及各种逆境胁迫中发挥非常重要的调控作用。本研究以菠萝为试验材料,采用RT-PCR技术克隆得到基因AcoNAC1(GenBank登录号:XM₀20225830),对其进行生物信息学及表达分析。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列全长1723 bp,ORF为1062 bp,编码353个氨基酸,相对分子量为38.34kDa,理论等电点为8.88;其编码蛋白的二级结构由20.40%的α-螺旋(H)和15.30%的β-折叠(E)以及59.21%的无规则卷曲(C)组成,具有NAC典型结构保守域。基因表达分析表明,AcoNAC1基因的表达受低温和干旱胁迫诱导,低温胁迫24 h和干旱胁迫12 h时的表达量最高;在不同成熟期品种中表现出持续的诱导表达,但诱导强度逐渐下降,其中早熟品种谢花后20～50 d及晚熟品种谢花后20～60 d基因表达量均处于较高水平。因此,推测AcoNAC1基因可能参与菠萝逆境胁迫响应以及果实发育与成熟的调控。     

香蕉中2条MaMLO基因的克隆及表达分析

MLO基因是一类植物特有的抗病基因,为了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了香蕉2条MLO基因,分别命名为MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明,MaMLO1的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸;MaMLO2的开放阅读框为1 689 bp,编码562个氨基酸。系统进化树分析表明,MaMLO1与已登录的香蕉MLO1(XP_009413424)亲缘关系较近,MaMLO2与已登录的香蕉MLO6(XP_009411538)亲缘关系较近。组织特异性研究表明,这2个基因在香蕉各器官中均有表达,但MaMLO2在根中的表达量最大。不同激素处理下的研究表明,MaMLO1受ABA、乙烯和水杨酸诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达;MaMLO2受ABA、乙烯、水杨酸和茉莉酸4种激素诱导上调表达。在感病品种中2个基因均是下调表达,在抗病品种中均是上调表达。结果表明,克隆到的2条MLO在感病品种中没有参与到香蕉抗枯萎病的过程,而在抗病品种中参与了香蕉抗枯萎病的过程。