多浪羊IFN-γ基因克隆及核苷酸序列分析

为了分析新疆多浪羊的IFN-γ基因,根据GenBank中NM_001009803的mRNA序列设计引物,以新疆多浪羊淋巴细胞的总RNA为模板,用RT-PCR扩增多浪羊IFN-γ基因序列。测序结果表明I,FN-γ基因序列包含了一个582 bp的开放阅读框,通过GenBank中的Blastn序列比较分析,多浪羊的IFN-γ基因与普通绵羊的同源性高达99.82%,为多浪羊IFN-γ的功能研究及多浪羊免疫应答基因的筛选奠定基础。     

多浪羊与和田羊初情期启动过程中生殖激素的变化规律

【目的】检测多浪羊与和田羊初情期启动过程中血清4种生殖激素(E2,FSH、LH、P4)的变化规律,为研究绵羊的初情期启动机制提供理论依据。【方法】利用公羊试情等方法对40只多浪羊与40只和田羊初情期年龄进行了鉴定;利用放射免疫分析技术对这2种绵羊2月龄、3月龄、初情期前、初情期(早期、中期、后期)、初情期后血清4种生殖激素的变化规律进行测定。【结果】多浪羊达到初情期的年龄约在4月龄,和田羊达到初情期的年龄约在8月龄。在幼年期至初情期的发育过程中,2种绵羊4种生殖激素变化趋势相似。多浪羊2月龄、3月龄血清E2浓度均显著高于和田羊(P0.05);多浪羊3月龄(初情期前)、初情期早期、中期血清FSH浓度均显著高于和田羊(P0.05),初情期后期血清P4浓度显著高于和田羊(P0.05)。多浪羊初情期后血清FSH、LH、P4浓度均显著高于和田羊(P0.05)。【结论】多浪羊初情期前高水平的E2、FSH可能与其初情期启动早相关,初情期后高水平的FSH浓度可能与其排卵数多、多胎性相关。     

多浪羊多胎基因全基因组关联分析研究

利用全基因组重测序技术,对多浪羊产羔性状进行了全基因组关联分析(GWAS),挖掘了绵羊繁殖性状相关候选基因及分子标记,结果表明:Fst检验结果共筛选出135个显著窗口,可以发现大部分的Fst值都集中在0.35~0.50之间。对筛选到的显著窗口进行基因注释,共得到51个基因。再进行富集分析后发现Fst的最大值为0.8710,且位于NCOA1基因内部。在雌配子发生条目中,多胎组和单胎组共同基因为INHBA。同样,利用ENSEMBLE数据库进行基因注释,共有28个基因与显著窗口有交集,如ACP1、ING5、ARNT等。这些候选基因和分子标记的揭示对绵羊繁殖性状功能基因的挖掘具有参考价值和理论意义。     

多浪羊多胎基因全基因组关联分析研究

利用全基因组重测序技术,对多浪羊产羔性状进行了全基因组关联分析(GWAS),挖掘了绵羊繁殖性状相关候选基因及分子标记,结果表明:Fst检验结果共筛选出135个显著窗口,可以发现大部分的Fst值都集中在0.35⁰.50之间。对筛选到的显著窗口进行基因注释,共得到51个基因。再进行富集分析后发现Fst的最大值为0.8710,且位于NCOA1基因内部。在雌配子发生条目中,多胎组和单胎组共同基因为INHBA。同样,利用ENSEMBLE数据库进行基因注释,共有28个基因与显著窗口有交集,如ACP1、ING5、ARNT等。这些候选基因和分子标记的揭示对绵羊繁殖性状功能基因的挖掘具有参考价值和理论意义。     

不同剂量褪黑素对多浪羊受胎及产羔效果的影响

【目的】研究褪黑素对多浪羊受胎及产羔效果的影响,提高多浪羊繁殖率。【方法】研究注射褪黑素提高受胎率和产羔率的方法,选择年龄、胎次、体况相似的57只多浪羊母羊,试验羊随机分为三组同时进行同期发情处理,并在撤栓36 h后皮下注射褪黑素注射剂。试验1组1 mL(5 mg)、试验2组2 mL(10 mg)、对照组0 mL。并在埋栓前(中午12:00)、撤栓时(中午12:00)、撤栓后36 h(晚上24:00)、配种时(撤栓后48 h,中午12:00)、配种后20 d五个时间段采集血清,采用放射免疫法对其褪黑素含量进行测定与分析;配种后第45d采用B超监测法检测三组的受胎率;在产羔后比较这三组的产羔率。【结果】试验1组受胎率显著高于试验2组和对照组(P0.05),试验2组与对照组之间差异不显著(P0.05);对产羔率而言,三组之间相互比较后无统计学差异(P0.05)。【结论】对多浪羊进行同期发情处理时,撤栓后36 h皮下注射1、2 mL褪黑素会提高受胎率,其中1 mL的受胎率高于2 mL,但是对产羔率无显著影响。     

新疆多浪羊白细胞介素8 cDNA的克隆测序及其变异SNP的分析

采集多浪羊的血液,分离白细胞,提取总RNA,用白细胞介素8（IL-8）的引物进行两步法的RT-PCR扩增、克隆与酶切鉴定,测序后进行序列比对,与NM_001009401.1同源性高达99%,初步判定为多浪羊的IL-8编码全长cDNA。通过序列比对,发现多浪羊IL-8的基因起始密码子上游第七个碱基发生突变,在NM_001009401.1中是T,而在测序的多浪羊的IL-8中是C。对该测序序列进行数据库搜索和序列比对,发现该碱基变异很独特,并对该变异可能对mRNA蛋白翻译的影响进行了初步的分析。     

多浪羊高繁殖力候选基因FecX^H位点SSCP分析

采用PCR—SSCP技术研究绵羊高繁殖力候选基因FecX^H位点在多浪羊中的单核苷酸多态性。试验结果表明,多浪羊中BMP15基因的FecX^H位点并不存在多态性,推断FecX^H位点与多浪羊多胎性状无关。     

多浪羊NCOA1基因多态性与产羔数的相关分析

分析研究了新疆多浪羊核受体辅激活蛋白基因(Nuclear receptor coactivator1 gene, NCOA1)的多态性及其与产羔数的相关性。结果表明:NCOA1基因存在两个多态位点,分别为内含子12的g.166 397 A>C突变位点和外显子17的g.187 501 G>A突变位点; g.166 397 A>C突变位点的优势基因为A等位基因,基因频率为0.968; g.187 501 G>A突变位点的优势基因为B等位基因,基因频率为0.643,且在该突变位点发生了错义突变,由原编码的丝氨酸(Ser)改变为谷酰胺酸(Gln);在多浪羊NCOA1基因的g.166 397 A>C突变位点,AA基因型个体的产羔数显著高于BB基因型个体的(P<0.05);在多浪羊NCOA1基因的g.187 501 G>A突变位点,BB基因型个体的产羔数显著高于AA和AB基因型个体的(P<0.05)。由此推断NCOA1基因可以作为多浪羊多羔性状的候选基因。     

多浪羊NCOA1基因多态性与产羔数的相关分析

分析研究了新疆多浪羊核受体辅激活蛋白基因(Nuclear receptor coactivator1 gene, NCOA1)的多态性及其与产羔数的相关性。结果表明:NCOA1基因存在两个多态位点,分别为内含子12的g.166 397 A>C突变位点和外显子17的g.187 501 G>A突变位点; g.166 397 A>C突变位点的优势基因为A等位基因,基因频率为0.968; g.187 501 G>A突变位点的优势基因为B等位基因,基因频率为0.643,且在该突变位点发生了错义突变,由原编码的丝氨酸(Ser)改变为谷酰胺酸(Gln);在多浪羊NCOA1基因的g.166 397 A>C突变位点,AA基因型个体的产羔数显著高于BB基因型个体的(P<0.05);在多浪羊NCOA1基因的g.187 501 G>A突变位点,BB基因型个体的产羔数显著高于AA和AB基因型个体的(P<0.05)。由此推断NCOA1基因可以作为多浪羊多羔性状的候选基因。     

日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊十二指肠细菌菌群结构的影响

【目的】研究日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊肠道细菌菌群结构的影响。【方法】选取25只3月龄体重(20±1.5) kg的健康多浪羊为试验动物,随机分为5组,每组5只羊,单栏饲养。葡萄籽添加比例分别为0%(对照组,A组)、4%(B组)、8%(C组)、12%(D组)、16%(E组)。预饲期15 d,正试期90 d。结束后屠宰,采集十二指肠食糜,利用16S rRNA测序技术分析肠道细菌菌群的结构。【结果】(1)样品测序覆盖率98.22%~98.82%,各组Alpha多样性差异不显著(P>0.05);25个样品测样出现了1 038个OTU,统计分析试验组与对照组差异均不显著(P>0.05);(2)门水平优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)与放线菌门(Actinobacteria),A组和B组拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度与C组、D组、E组相比差异显著(P<0.05)。(3)Aeriscardovia为A、B、C、E四组第一优势菌群,占比最高,而D组第一优势菌群为毛螺菌科NK3A20属(Lachnospiraceae_NK3A20_group)。【结论】日粮中添加不同比例葡萄籽不影响多浪羊肠道细菌多样性,但影响部分菌群丰度。     

牦牛DRA基因克隆测序及生物信息学分析

为全面解析牦牛MHCⅡ类基因结构与功能，采用分子克隆测序技术对大通牦牛DRA基因编码区进行等位基因频率估算并进行生物信息学分析。结果显示：大通牦牛DRA基因编码区含有762 bp的开放阅读框，共编码253个氨基酸；共有3个SNPs(g.2376C>T、g.2851C>G、g.3016C>A),其中第2、3外显子分别存在1个C→T的同义突变和C→A的错义突变(L→M),这两个突变均降低了大通牦牛DRA基因mRNA二级结构的稳定性；g.3016C>A突变前后编码蛋白质的分子量、原子总数、脂肪系数、不稳定系数、总平均亲水性方面存在差异；生物信息学的方法分析显示，BoLA-DRA基因是MHC基因家族中高度保守的基因。该研究结果可以为大通牦牛DRA基因结构与功能的研究奠定基础。     

陆川猪CSRP3基因克隆及其组织表达差异分析

【目的】克隆陆川猪的富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3(CSRP3)基因,并对其进行生物信息学和组织表达谱分析,为研究CSRP3基因在陆川猪肌肉生长过程中的作用机制打下基础。【方法】根据NCBI已公布的野猪CSRP3基因序列设计特异性定量引物和克隆引物,运用RT-PCR克隆CSRP3基因并进行生物信息学在线分析,采用实时荧光定量PCR检测CSRP3基因在陆川猪各组织中的表达差异。【结果】陆川猪CSRP3基因编码区(CDS)全长854 bp,编码194个氨基酸残基,与NCBI已公布的野猪CSRP3基因CDS序列相比存在5处同义碱基突变,且陆川猪与野猪氨基酸序列相似性达100.0%;陆川猪CSRP3基因的编码蛋白分子量为20935.82 Da,分子式为C₉₆₄H₁₄₀₄N₂₆₂O₂₇₄S₁₉,理论等电点(pI)为8.89,不稳定系数为39.11,表明其是偏碱性的稳定蛋白;CSRP3蛋白二级结构主要由无规则卷曲构成,三级结构可能有一种模型;陆川猪CSRP3蛋白除有多个磷酸化位点之外,无跨膜结构和信号肽;陆川猪CSRP3基因在心脏中表达量最高,背最长肌次之,在肝脏中的表达量最低。【结论】CSRP3基因在陆川猪心脏中表达量最高,背最长肌次之且明显高于其他组织,说明该基因可能对肌肉生长有一定影响。     

广灵驴PPARγ基因克隆与组织表达分析

以广灵驴作为试验材料,使用RT-PCR方法对广灵驴PPARγ基因CDS编码区进行克隆然后对序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ基因在广灵驴的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪7种组织中的表达特征.结果表明,广灵驴PPARγ基因含有1个1 425 bp的开放阅读框,可编码474个氨基酸残基,其核苷酸序列与马的同源性最高;PPARγ蛋白是一种酸性不稳定的亲水性蛋白,二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲4种形式组成,蛋白序列中具有3个结构域和48个磷酸化位点,无信号肽剪切位点以及跨膜区域,主要定位在细胞质和细胞核中;PPARγ基因在广灵驴的7种不同组织中均有表达但存在一定差异,在皮下脂肪中的表达水平最为丰富.本试验成功克隆了广灵驴PPARγ基因,并发现其在皮下脂肪中有较高的表达水平,说明PPARγ基因可能与广灵驴脂肪沉积有关.     

陆川猪MYL9基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪肌球蛋白调节轻链9基因(MYL9),并进行生物信息学分析及检测其在不同猪种中的表达差异,为明确陆川猪骨骼肌生长规律及研究MYL9的生理功能打下基础.[方法]根据NCBI上的家猪MYL9基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆陆川猪MYL9基因,利用在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测陆川猪和杜洛克猪背最长肌中MYL9基因的表达情况.[结果]陆川猪MYL9基因编码区(CDS)序列长519 bp,共编码172个氨基酸;与NCBI上已公布的家猪MYL9基因(NM_001244472.1)CDS序列比对,陆川猪MYL9基因存在2处碱基突变,分别是195 bp处C→A和498 bp处T→C,均为同义突变;陆川猪MYL9基因推导氨基酸序列与家猪MYL9基因推导氨基酸序列的同源性最高,为99.6%,与鸡的同源性最低,为88.4%.陆川猪MYL9蛋白存在3个N糖基化位点和15个磷酸化位点,不存在跨膜结构域和信号肽,符合一般EFh-PEF超家族的结构特征.陆川猪MYL9蛋白二级结构中α-螺旋占54.65%,无规则卷曲占35.47%,β-转角占8.14%,延伸链占1.74%.MYL9基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于陆川猪背最长肌(P<0.01).[结论]MYL9基因序列在不同物种中具有较高的保守性,其在10周龄陆川猪背最长肌中的相对表达量极显著低于杜洛克猪,与其在不同猪种背最长肌中的磷酸化程度有关,也说明MYL9基因对猪肌肉生长速度有一定影响.     

苦荞FtCAD-1和FtCAD-2基因克隆及组织表达分析

【目的】克隆苦荞肉桂醇脱氢酶（CAD）基因并分析其组织表达特性,为深入研究CAD基因在苦荞果壳形成中的分子调控机制提供理论依据。【方法】基于苦荞转录组测序结果,从苦荞厚果壳品种云荞1号和薄果壳品种小米荞克隆CAD基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CAD基因在不同果壳厚度类型（厚果壳苦荞和薄果壳苦荞）不同组织的表达情况。【结果】从薄果壳苦荞和厚果壳苦荞中均克隆获得2条苦荞CAD基因,且这2条基因序列在薄果壳苦荞与厚果壳苦荞中均完全一致,命名为FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的开放阅读框（ORF）长度为876bp,编码291个氨基酸残基,为疏水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质;FtCAD-2基因的ORF长度为1083bp,编码360个氨基酸残基,为亲水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞质。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3个典型的保守结构域,且不具有跨膜结构域和信号肽,属于非分泌蛋白。FtCAD-1与数据库目标蛋白2cf5.1.B的结构相似度为74.74%,而FtCAD-2与数据库目标蛋白5z0c.1.A的结构相似度为63.03%。FtCAD-1与拟南芥的第一类CAD蛋白（AtCAD4和AtCAD5）的亲缘关系较近;FtCAD-2与拟南芥的第二类CAD蛋白（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等）的亲缘关系较近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在种仁中的相对表达量最高,且厚果壳苦荞与薄果壳苦荞间无显著差异（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果壳苦荞叶、花和果壳中的相对表达量显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01）高于薄果壳苦荞,尤其是在厚果壳苦荞果壳中相对表达量是薄果壳苦荞的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果壳苦荞果壳中相对表达量显著高于厚果壳苦荞外,在其他组织中的相对表达量均表现为厚果壳苦荞高于薄果壳苦荞。【结论】FtCAD-1属于第一类CAD基因,具有明显的组织表达特异性,推测其在苦荞木质素生物合成过程中发挥重要调控作用。     

民猪NUMB基因克隆与组织表达分析

研究采用RT-PCR技术结合克隆测序方法,克隆出全长2 004 bp NUMB基因序列,其中包括1 782 bp开放读码框,该基因编码592个氨基酸。利用生物信息学分析软件对该基因氨基酸序列预测与分析发现:NUMB蛋白二级结构中,转角占很大比例,且蛋白亲水性较强,结构功能域分析发现该蛋白多肽链存在一个N端磷酸酪氨酸结构域(PTB),位于第37~162氨基酸之间。基于不同物种NUMB蛋白序列所构建分子进化树表明,猪与牛、骆驼亲缘关系最近,而与斑马鱼最远。在m RNA水平上,NUMB基因肺中表达量最高,大肠中表达量最低。     

陆川猪ANKRD1基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪心肌锚蛋白重复域1基因(ANKRD1),并进行生物信息学及组织表达谱分析,为研究ANKRD1在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据.[方法]根据NCBI已公布的野猪ANKRD1基因序列(NM_213922.1)设计特异性引物,采用TRIzol法提取陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板进行ANKRD1基因克隆,通过MegAlign、Protaram、Protscale、MHMM Server和Sig-nalP等在线分析软件进行生物信息学分析,最后以实时荧光定量PCR检测ANKRD1基因在陆川猪各组织中的表达情况.[结果]陆川猪ANKRD1基因蛋白编码区(CDS)序列全长960 bp,编码319个氨基酸残基,与NCBI已公布野猪ANKRD1基因(NM_213922.1)的CDS序列存在4处碱基突变,但均为同义突变,二者的ANKRD1氨基酸序列同源性为99.6%.陆川猪ANKRD1基因编码蛋白分子量为36125.70 Da,理论等电点(pI)为7.09,属于稳定蛋白,其二级结构中α-螺旋占46.39%、无规则卷曲占39.81%、β-转角占9.09%、延伸链占4.70%;陆川猪ANKRD1蛋白不存在跨膜结构,也无信号肽,有多个磷酸化位点.陆川猪ANKRD1基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等7个组织中均有表达,其中以心脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同),在脾脏中的相对表达量最低,显著低于在心脏、肝脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量.[结论]ANKRD1基因在陆川猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等组织中均有表达,且存在明显差异,故推测ANKRD1基因在不同组织中发挥不同作用.     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

多浪羊非繁殖季节同期发情、妊娠及激素水平的观察与测定

在非繁殖季节,对不同FecB基因型多浪羊母羊进行海绵栓配合激素的同期发情处理。结果表明:B+和++基因型多浪羊组在60 h内的总发情率分别为83.67%和85.60%,差异不显著;人工授精后B+基因型母羊的受胎率为65.85%,与++型母羊的受胎率(67.65%)差异不显著;B+基因型群体血清中在4个时间点的平均E2浓度和平均P4浓度分别极显著(P0.01)和显著(P0.05)高于++基因型的,且前者的平均FSH浓度和平均LH浓度也高于后者的,但差异均不显著。因此,在非繁殖季节,对多浪羊进行同期发情处理,其发情率和受胎率不受FecB基因突变的影响;FecB基因突变不影响FSH和LH的分泌,但会导致E2和P4分泌的增加。