体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]分离和克隆小鼠骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经元样细胞。[方法]利用Percoll密度梯度离心的方法进行小鼠骨髓间充质干细胞分离及培养,分别采用β-巯基乙醇和BHA诱导分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。[结果]经2种诱导剂诱导的小鼠骨髓间充质干细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。而且免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞神经元特异性烯醇化酶染色和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学染色均呈阳性,β-巯基乙醇诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（86.8±2.7）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（75.2±2.3）%;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（80.5±2.2）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（73.2±1.6）%。[结论]小鼠骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和BNA的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

犬脂肪间充质干细胞的分离、分化与鉴定

[目的]本试验旨在分离、多向诱导分化并鉴定犬脂肪间充质干细胞。[方法]无菌条件下采取经过健康筛查的犬腹部脂肪,机械剪碎,采用1 g·L~(-1)胶原酶Ⅰ型消化,用DMEM+10%FBS培养,观察细胞形态特征,流式细胞术分析细胞表面抗原标志的表达,并检测其体外成脂、成骨、成软骨分化能力。[结果]运用酶消化法可以从犬新鲜脂肪组织中分离到脂肪间充质干细胞,流式分析结果显示其高表达CD29(99.9%),低表达CD34(0.5%)和CD45(0.3%)。这些细胞在体外经诱导可以分化成为骨、软骨和脂肪。[结论]犬腹部脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力。     

人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞生长的影响

为探讨人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞生长的影响,利用差速超速离心法提取人脐带间充质干细胞源外泌体,并用透射电子显微镜、Western blot方法鉴定外泌体形态、粒径和蛋白质;利用CCK-8法、细胞划痕试验、Transwell试验检测不同浓度人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响.结果表明:人脐带间充质干细胞源外泌体呈杯托状,平均粒径70 nm左右,表达标志性蛋白CD63和CD9.不同浓度人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力有促进作用,且呈时间、剂量依赖性,并在人脐带间充质干细胞源外泌体浓度为300μg·mL-1时达到最高,而在浓度为400 pg·mL-1时促进率开始明显下降.     

外泌体miR-218抑制脂多糖诱发子宫内膜上皮细胞免疫因子释放研究

[目的]探究奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体及其miR-218在减轻大肠杆菌脂多糖诱发免疫反应中的作用.[方法]用不同质量浓度大肠杆菌脂多糖作用于奶牛子宫内膜上皮细胞系24 h后采用细胞计数试剂盒检测细胞活性;酶联免疫吸附测定检测免疫因子IL-1β和TNF-α释放;采用透射电子显微镜和蛋白印记法验证提取外泌体的粒径和标识蛋白CD63表达,荧光定量聚合酶链式反应法检测外泌体中miR-218表达变化;采用激光共聚焦显微镜观察外泌体与奶牛子宫内膜上皮细胞融合;细胞转染mimics 218检测其对大肠杆菌脂多糖诱发奶牛子宫内膜上皮细胞免疫因子释放的影响.[结果]100μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞后,IL-1β、TNF-α含量均显著高于对照组(P＜0.05);大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量极显著低于奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量(P＜0.01);正常培养奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体能够与大肠杆菌脂多糖处理的奶牛子宫内膜上皮细胞融合并与NF-KB (p65)蛋白共定位于细胞质中.将奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体加入到100 μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞24 h后,显著抑制了大肠杆菌脂多糖引起的奶牛子宫内膜上皮细胞培养上清中的IL-1β和TNF-a释放(P＜0.05).同样的,转染进奶牛子宫内膜上皮细胞内mimics 218与磷酸化的NF-KB (p65)核外部分共定位并显著抑制了大肠杆菌脂多糖诱发的奶牛子宫内膜上皮细胞中TNF-α释放(P＜0.05),而对IL-1β释放无显著差异.[结论]miR-218能够随着健康子宫内膜上皮细胞分泌外泌体进入到受到大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞内,并与磷酸化p65核外部分共定位并抑制大肠杆菌脂多糖引起的TNFα的释放.     

脐带间充质干细胞及其外泌体对宫颈癌HeLa细胞的作用初探

人脐带间充质干细胞是一种多能干细胞,可用于多种疾病的临床治疗。利用从人类脐带分离的间充质干细胞,以及从该间充质干细胞的培养液中分离提取的外泌体,通过与宫颈癌HeLa细胞共培养,研究间充质干细胞及其外泌体对HeLa细胞生物学表型的影响。结果表明:脐带间充质干细胞共培养均极显著抑制HeLa细胞的增殖、迁移及侵袭等表型,并极显著促进HeLa细胞凋亡。脐带间充质干细胞来源的外泌体处理HeLa细胞后,细胞增殖、迁移及侵袭也同样受到极显著抑制,并极显著促进细胞凋亡。这一研究提示脐带间充质干细胞及其外泌体并未在体外培养条件下促进HeLa细胞的生长、迁移,相反对HeLa细胞的表型具有一定的抑制作用。     

胎猪胰岛源胰腺干细胞分离培养与诱导分化试验

 【目的】分离培养胎猪胰腺干细胞对其进行功能检测。【方法】用先悬浮后贴壁的方法从胎猪胰岛获得胰腺干细胞，用免疫组化方法鉴定该细胞，以MTT法测定其不同代次的生长活性，诱导该细胞成为胰腺内分泌细胞并检测其功能。【结果】分离得到的细胞不表达nestin，而表达导管上皮细胞标志ck-19、平滑肌标志α-actin,其在体外的生长行为有类似胚胎干细胞样生长形态，细胞体外增殖活力很强，现已传至18代，细胞经诱导后分化为分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞，并且伴随着细胞超微结构的改变。【结论】通过本方法可以分离到胎猪胰腺干/祖细胞，经诱导分化可形成有功能的胰岛样细胞团并释放胰岛素。     

胚胎造血干Sca-l+细胞向肝细胞分化的研究

目的 探讨胚胎造血干细胞抗原阳性(Sca-l ) 细胞亚群在合适的体外诱导体系下向肝细胞或肝细胞前体分化的可行性.方法 免疫磁性分离法分离Sca-l 细胞,相差显微镜观察细胞形态,RT-PCR法检测细胞白蛋白(ALB)、转甲状腺蛋白mRNA水平表达,免疫组织化学法检测AFP和CK8/18蛋白水平的表达,以及检测细胞糖原染色和尿素合成功能.结果 免疫磁性分离法分离Sca-l 细胞能达到(85.57±1.66)%的纯度(P<0.01),对分离前后细胞活力的影响小(P<0.05).随着诱导分化时间延长,细胞形态明显向肝细胞变化,AFP表达消失、CK8/18蛋白表达升高,ALB、转甲状腺蛋白mRNA表达升高,且细胞糖原染色和尿素合成功能增强,逐渐向成熟肝细胞转化.结论 免疫磁性分离法能够分离出较高纯度的胚胎造血干Sca-1 细胞,并能够向肝脏细胞分化.     

鸡胚来源的外泌体不同提取方法比较

【目的】鸡胚蛋可用于改善机体免疫功能,研究不同提取方法对鸡胚组织中外泌体的分离效果,有利于深入解析鸡胚蛋生理功能。【方法】收集13胚龄惠阳胡须鸡胚蛋12枚(3组,4枚/组),通过酶消化、差速离心及过滤等前处理后将所获样品分为4份,通过超速离心法(UC)、蔗糖垫超速离心法(SDUC)、膜亲和法(exoEasy)以及聚乙二醇沉淀法(ExoQuick)4种方法分离提取外泌体,分别标记A～D。比较BCA蛋白浓度测定、透射电镜、纳米流式和标志蛋白流式检测等4种方法获得的外泌体蛋白浓度、形态、大小及其标志性蛋白表达情况。【结果】4种方法均能获得符合外泌体直径分布(40～200 nm)、具有外泌体典型微囊结构特征的囊泡物质,外泌体蛋白浓度和颗粒浓度由高到低依次为DCAB,但D样品中含有其他聚团杂质蛋白;表面标志蛋白CD63、CD81阳性率变化趋势为BDCA。【结论】综合考量外泌体的纯度、形态、大小及其标志性蛋白表达情况,根据供试组织样品来源、试验条件和目的可优选蔗糖垫超速离心法或膜亲和法,如需高纯度外泌体可首选蔗糖垫超速离心法,样品稀有或不具备超速离心设备则选用膜亲和法。     

钙敏感受体及下游PLC/TRPM5介导苯丙氨酸刺激猪十二指肠分泌胆囊收缩素

[目的]本文旨在探究苯丙氨酸(Phe)体外灌流对猪十二指肠组织胆囊收缩素(CCK)分泌的影响,以及钙敏感受体(CaSR)、鲜味受体(T1R1/T1R3)、下游磷脂酶C(PLC)和瞬时受体电位离子通道蛋白5(TRPM5)在该过程中的作用。[方法]以猪十二指肠为研究对象,利用免疫印迹技术检测CaSR在猪十二指肠上的表达;在此基础上,利用组织体外灌流系统探究Phe对猪十二指肠CCK分泌的影响,再通过抑制剂或激活剂揭示CaSR、T1R1/T1R3以及PLC和TRPM5对CCK分泌的作用。[结果]猪十二指肠表达CaSR;50 mmol·L~(-1)L-Phe而非D-Phe能够显著刺激CCK的分泌(P0.05);加入CaSR抑制剂NPS 2143(25μmol·L~(-1))或calhex 231(20μmol·L~(-1))均可显著抑制L-Phe诱导的CCK分泌(P0.05),但加入T1R1/T1R3激活剂肌苷酸(IMP,2.5 mmol·L~(-1))或抑制剂lactisole(5 mmol·L~(-1))后CCK的分泌并无显著变化(P0.05);通路下游PLC抑制剂U-73122(10μmol·L~(-1))和TRPM5抑制剂氧化三苯基磷(TPPO,100μmol·L~(-1))均可显著抑制L-Phe诱导的CCK分泌(P0.05)。[结论]L-Phe通过激活CaSR以及下游PLC/TRPM5刺激猪十二指肠组织分泌CCK。     

白消安对仔猪睾丸曲精小管内增殖分化相关蛋白表达与定位的影响

为了研究白消安对仔猪睾丸曲精小管内增殖分化相关蛋白PCNA、PLZF和GATA4表达与定位的影响，试验选取体外培养仔猪曲精小管为研究对象，分为对照组和试验组，其中试验组各添加5 mg/kg白消安，分别培养1、2、3 d，离心获取曲精小管，采用HE染色检测形态变化，采用免疫组化、qRT-PCR和Western blot法分别检测PCNA、PLZF和GATA4表达和定位的变化。HE染色结果显示，各试验组曲精小管内均含有支持细胞和生殖细胞；免疫组织化学结果显示，各试验组的PCNA蛋白定位于生殖细胞和支持细胞的细胞核，白消安作用可导致PCNA染色变深，表达量升高。各试验组GATA4蛋白定位于支持细胞的细胞核，且与对照组相比无明显差异；各试验组的PLZF蛋白定位于生殖细胞的细胞核，与对照组相比，白消安作用2 d时PLZF染色无显著差异，白消安作用1、3 d时PLZF染色变深，表达量升高。qRT-PCR和Western Blot结果显示，与对照组相比，试验组PCNA和GATA4 mRNA及其蛋白表达量均显著升高；白消安作用2 d的PLZF mRNA和蛋白表达量差异不显著，白消安作用1、3 d的PL...     

猪圆环病毒2型感染树突状细胞外泌体中差异miRNA分析

[目的]本研究旨在探究猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）感染中,树突状细胞（Dendritic cell,DC）外泌体miRNA在调节免疫反应中的作用。[方法]以正常的单核细胞来源树突状细胞（MoDC）来源外泌体（DEX）为空白对照组,病毒感染的MoDC来源外泌体（VDEX）为试验组,使用间接免疫荧光评估感染模型鉴定外泌体后,通过高通量测序技术分析两者中的差异miRNA。[结果]间接免疫荧光结果显示,与PCV2共孵育的MoDC中有特异性绿色荧光,表明PCV2感染MoDC模型建立成功。纳米颗粒追踪技术结果显示,超速离心法提取的外泌体直径分别为130 nm和120 nm。Western blot结果显示,两组外泌体均存在特异性标记蛋白CD63和TSG101。高通量测序结果显示,与DEX组相比,VDEX组共504种miRNA发生显著变化（P<0.05）,其中161种表达上调,343种表达下调。qPCR结果表明,与DEX相比,VDEX中ssc-miR-10b、ssc-miR-199a-3p-R-1、ssc-miR-532-5p、ssc-miR...     

IL-1α诱导胚鼠中脑神经干细胞分化的实验研究

目的:在胚鼠中脑曲分离神经干细胞,探讨IL-1α诱导胚鼠中脑神经干细胞分化为多巴胺神经元的效能.方法:体外分离、培养小鼠胚胎的中脑神经干细胞,加入IL-1α诱导其分化,通过巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化鉴定,并统计分析其诱导效能.结果:胚鼠中脑的腹侧中脑曲部位分离获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的细胞球,且能分化为神经元和神经胶质细胞;IL-1α能明显提高NSC定向分化为多巴胺能神经元比例(IL-1α组14.3%±0.8%vs对照组2.6%±0.3%,P＜0.05).结论:胚鼠中脑存在有多向分化潜能的神经干细胞和中脑神经干细胞被IL-1α诱导向多巴胺能神经元的分化比例明显升高.     

枸杞多糖对小鼠精原干细胞增殖作用的影响

[目的]观察枸杞多糖(LBP)对体外培养的小鼠精原干细胞的增殖作用。[方法]选2～5日龄的ICR小鼠,采用多次贴壁法纯化精原干细胞培养3 d,加入不同浓度的LBP,利用MTT比色分析法和Brdu增殖细胞标记法,检测不同浓度LBP对体外培养精原干细胞增殖的影响。[结果]与对照相比,用LBP处理后的精原干细胞的细胞数量明显增多,高浓度的LBP(200μg/ml)对精原干细胞的增殖有明显的促进作用(P<0.01)。[结论]LBP能够促进精原干细胞的增殖。     

APP蛋白家族胞内段释放与神经干细胞向神经元细胞定向分化的关系研究

[目的]研究APP家族胞内段对神经细胞定向分化的影响。[方法]通过分离体外培养神经干细胞,转染导入APP蛋白家族胞内段以过表达后,研究其对神经干细胞向神经元定向分化的影响。[结果]APP家族蛋白胞内段的过表达可以抑制神经干细胞向神经元细胞的分化,其中APP和APLP2胞内段的影响尤为显著。突变试验表明,通过Capase水解释放末端31氨基酸片断是这个过程必需的。APP家族胞内段是通过释放APP-ICD31来抑制神经干细胞向神经元细胞的定向分化。[结论]该研究进一步证实了APP蛋白和老年痴呆病发生的联系,也为老年痴呆症的治疗提供新的靶点。     

猪精原干细胞体外培养条件的优化

以出生后1～5 d的长白公猪为主要研究对象,采用两步酶消化法获取睾丸细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法对猪精原干细胞(PSSCs)进行纯化,以碱性磷酸酶(AP)染色鉴定;利用MTT法检测2种细胞因子——胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对PSSCs发育的影响.结果表明:用Percoll不连续密度梯度法获得的PSSCs占睾丸总细胞数的(8.19±0.83)%,AP染色的阳性率为(87.47±2.90)%,表明该方法可有效获取PSSCs;MTT法检测表明,20 ng.mL-1 GDNF+1 000 U.mL-1 LIF的组合添加对PSSCs体外增殖的效果最好.     

胚胎造血干Sca-1^＋细胞向肝细胞分化的研究

目的探讨胚胎造血干细胞抗原阳性(Sca-1~ )细胞亚群在合适的体外诱导体系下向肝细胞或肝细胞前体分化的可行性。方法免疫磁性分离法分离Sca-1~ 细胞,相差显微镜观察细胞形态,RT-PCR法检测细胞白蛋白(ALB)、转甲状腺蛋白mRNA水平表达,免疫组织化学法检测AFP和CK8/18蛋白水平的表达,以及检测细胞糖原染色和尿素合成功能。结果免疫磁性分离法分离Sca-1~ 细胞能达到(85.57±1.66)%的纯度(P<0.01),对分离前后细胞活力的影响小(P<0.05)。随着诱导分化时间延长,细胞形态明显向肝细胞变化,AFP表达消失、CK8/18蛋白表达升高,ALB、转甲状腺蛋白mRNA表达升高,且细胞糖原染色和尿素合成功能增强,逐渐向成熟肝细胞转化。结论免疫磁性分离法能够分离出较高纯度的胚胎造血干Sca-1~ 细胞,并能够向肝脏细胞分化。     

毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究

[目的]本试验旨在研究毛喉素(FSK)对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及机制.[方法]体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞,预培养24 h.用10 nmol·L-1 FSK处理细胞48 h,检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达状况;处理96 h后检测孕酮(P4)水平及类固醇合成相关蛋白的表达水平.[结果]与...     

乳腺炎对牛奶外泌体功能的影响：基于乳腺上皮细胞的观察

通过观察乳腺炎牛奶外泌体对乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells, MECs)活力和天然免疫功能的影响,探究外泌体在乳腺炎发病机制中的作用。MECs经热灭活的乳腺炎病原(大肠埃希菌)刺激24 h后进行转录组测序和基因本体(gene ontology, GO)富集分析,发现有21条差异表达基因富集在细胞外囊泡外泌体(GO:0070062)这一细胞组分上,提示感染可引起宿主细胞外泌体生物学功能改变。在此基础上,采用正常牛奶来源的外泌体(N-exo)和乳腺炎牛奶来源的外泌体(M-exo)作用MECs,以培养于不含外泌体的培养基中的细胞为对照,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(methyl-thiazol-diphenyltetrazolium, MTT)法检测细胞活力,并采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测MECs中白细胞介素8(interleukin-8, IL-8)、白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表达。结果发现:正常牛奶外泌体对MECs活力无显著影响,而乳腺炎牛奶外泌体可显著抑制MECs活力;2种来源的外泌体对IL-8和TNF-α的表达均无显著影响,但正常牛奶外泌体可诱导表达IL-1β,而乳腺炎牛奶外泌体则缺乏诱导IL-1β表达的能力。上述结果提示,在乳腺感染过程中,进入牛奶中的外泌体可引起MECs活力下降,并可能参与介导有利于病原逃避免疫的微环境的形成。因而,在乳腺炎发病机制中,外泌体可能起着促进乳腺感染扩散的作用。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。