猪IgG Ⅱ类Fc受体基因真核表达重组质粒的构建及表达

利用本研究小组克隆的猪IgG Ⅱ类Fc受体cDNA(swFcγRⅡ)基因序列(DQ026064)设计引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增了完整的960 bpswFcγRIIORF序列,利用基因重组技术将swFcγRIIORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,经PCR及双酶切鉴定:扩增出901 bp的PCR产物;KpnI/EcoR I双酶切,切出5 376和901bp DNA片段,表明重组质粒pcDNA/swFcγRⅡ构建成功。然后脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验鉴定了swFcγRII配体亲和特性。     

外源γ-氨基丁酸(GABA)对小麦苗期耐涝性的影响

以冬小麦京都40和春小麦辽春17为材料,用0(对照CK),50,500 mg/L3个浓度的γ-氨基丁酸(GABA)浸种处理,小麦幼苗高约10 cm后进行涝害胁迫,持续3 d,研究外源GABA对小麦幼苗耐涝性的影响。结果表明,适当浓度的GABA处理可以明显提高小麦幼苗的耐涝性。在涝害条件下,50 mg/L GABA处理能使辽春17株高增加17.5%,京都40增加28.8%,根系总长度分别增加46.58%和11.9%。同时叶绿素含量及Fv/Fm,DPPH活性氧清除能力均能维持较高水平,膜脂过氧化水平减轻,MDA积累量降低。GABA可能通过调节光合叶绿素系统和抗氧化酶系统来减少涝害胁迫引起的生长抑制现象,从而增强小麦耐涝性。     

滇牡丹(Paeonia delavayi)二氢黄酮醇4-还原酶基因的鉴定及表达

为了研究二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)对滇牡丹(Paeonia delavayi)花瓣中花色形成的作用,本研究采用RT-PCR技术首次从滇牡丹中克隆得到一个具有完整开放阅读框的二氢黄酮醇4-还原酶基因(PdDFR),生物信息学分析和转录模式分析显示,该基因全长1 050 bp,共编码349个氨基酸,其蛋白序列与黄牡丹(Paeonia lutea) DFR的蛋白序列具有99.00%的一致性。序列比对分析显示PdDFR基因存在一个由21个氨基酸组成的NADPH结合位点VTGATGYIGSWLVKTLLERGN。滇牡丹PdDFR蛋白与黄牡丹(Paeonia lutea, ALX35996.1)、蓖麻(Ricinus communis, XP015577076.1)、木薯(Manihot esculenta, XP021607-041.1)的DFR蛋白聚为一类;转录模式分析表明PdDFR基因在红色花瓣中有表达,在根、茎、叶中不表达。本研究通过对滇牡丹转录组数据的分析,分离并克隆得到PdDFR基因,为利用基因工程技术选育优良滇牡丹花卉品种提供理论参考。     

栀子(Gardenia jasminoides)GGPPS基因小亚基的克隆及表达分析

香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)是单萜的前体物质,而单萜是栀子内重要的活性成分。香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)在萜类化合物、类胡萝卜素类化合物生物合成中处于关键位置,GGPPS主要分为香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基(GGPPSlsu)和香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基(GGPPSssu)。为了研究栀子GGPPS基因在栀子萜类生物合成中的作用,本研究成功从栀子品种‘林海一号’中提取RNA反转录合成cDNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到栀子GGPPSssu的cDNA序列,分别命名为GjGGPPSssu1和GjGGPPSssu2,ORF区分别为1053 bp和915 bp。通过构建基因进化树,栀子GGPPSssu基因和其他植物的GGPPSssu基因聚为一类,属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因。通过蛋白质序列比对表明GjGGPPSssu1有一个CxxxC(x为碱性氨基酸)的保守基元和一个FARM的保守基元,没有SARM保守基元,与SSUⅡ类基因相似;GjGGPPSssu2有两个CxxxC的保守基元,没有FARM保守基元和SARM保守基元,与SSUⅠ类基因相似。荧光定量PCR试验结果表明,GjGGPPSssu1在T4和T5时期有较高的表达水平,GjGGPPSssu2在栀子各生长时期的根部和果实中有较高水平的表达。推测GjGGPPSssu1基因与栀子黄色素合成相关,GjGGPPSssu2基因与单萜合成相关。本研究初步解析了栀子GGPPS基因的功能,为提高栀子药用品质提供了理论依据。     

H5N1亚型禽流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因的进化及原核表达

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

大豆PIN-Like(PILS)基因家族的鉴定、表达分析及在根瘤共生固氮过程中的功能

植物激素生长素在植物的生长发育过程中发挥了至关重要的作用,它的稳态和浓度梯度建立控制了几乎所有器官的极性建成。生长素在特定细胞中合成、运输、感知以及代谢降解建立了符合器官发育的生长素浓度梯度。在豆科植物中,根与土壤微生物互作形成了根瘤这一特殊的器官,进行生物固氮。然而,生长素稳态控制生物固氮的功能还未知。拟南芥中的研究表明,PIN-Like (PILS)蛋白协助调节的细胞内生长素稳态,并介导下游细胞核内的生长素信号传递。本研究以大豆作为研究模型,在大豆基因组中鉴定获得19个PILS家族基因(GmPILS),不均匀分布于大豆10条染色体上。GmPILS在大豆9种组织部位中表现出多种表达模式,且具有明显的组织表达特异性。GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤菌体区域富集表达,使用人工微RNA沉默(artificialmicro RNA interference,amiRNAi)下调GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤的表达,导致根瘤的固氮酶活性上升,而过量表达GmPILS1f导致根瘤的固氮酶活性下降,因此GmPILS1e和GmPILS1f可能参与大豆固氮酶活性的调节。这些结果为进一步解析大豆GmPILS家族基因的功能和作用机制奠定了基础,同时也为结瘤固氮在农业育种中的应用提供了有价值的基因资源。     

滇水金凤黄烷酮3-羟化酶基因(IuF3H)的克隆及表达分析

为探究黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因对滇水金凤(Impatiens uliginosa)花色的调控机制.本研究以红色滇水金凤花器官为试验材料,通过RT-PCR及RACE技术分离克隆F3H基因,发现其cDNA序列全长1 104 bp,编码367 aa,故命名为IuF3H;同...     

拟南芥尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)基因启动子的分离及表达特性分析

尿黑酸叶绿醇转移酶（HPT）是催化生育酚生物合成分支途径中的关键酶,催化叶绿醇焦磷酸（phytyl-PP）与尿黑酸（HGA）缩合生成生育酚的前体。从拟南芥中分离HPT基因的启动子序列946 bp,构建了该启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,取正常生长条件下的拟南芥转基因植株进行GUS组织化学染色,结果表明,在HPT启动子的驱动下,GUS基因主要在转基因拟南芥的根中高表达,在成熟叶片、花丝、雌蕊中也有一些表达,而在茎、根尖、花药、种荚及发育的种子中则未表达,可见该启动子为根优势表达启动子。     

绵羊Toll样受体家庭在肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激对TLR2、TLR4表达的影响

为确定toll样受体家族在绵羊肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激过程中TLR2、4的动态表达规律.通过RT-PCR方法检测绵羊TLR1-TLR10表达分布;以α-tubulin和GAPDH为内标基因,对绵羊TLR2、4进行克隆和测序,将重组质粒作为标准品建立实时定量PCR标准曲线,通过实时定量PCR方法检测LPS诱导0～48 h TLR2、4的动态表达.结果表明,在绵羊肺泡巨噬细胞中检测到TLR1、2、4、6、7、8、9、10的表达,而TLR3、5未见表达;α-tubulin和GAPDH在LPS诱导前后表达量存在显著差异,均不适合作为内标基因,以使用的细胞数和总RNA量进行均一化校正,发现TLR2、4在诱导后20 min就达到高峰,且在整个诱导过程中维持较高水平.绵羊肺泡巨噬细胞TLR2、4对LPS刺激的应答反应很灵敏,参与机体的早期应答反应.