斑马鱼il-11b基因5'端启动子序列及体外活性分析

白细胞介素11（Interleukin-11,IL-11）是白细胞介素家族的重要成员,其在伤口愈合、癌细胞迁移及免疫调控等过程中起到关键作用。为了深入研究IL-11的转录调控机制,本实验通过生物信息学分析,找出斑马鱼il-11b基因的3000bp启动子序列,经缺失处理获得2908bp、2000bp、1000bp和500bp不同片段,进行PCR扩增并与pGL3-enhancer载体重组构建pGL3-il-11b-promoter-enhancer 报告基因质粒,接着转染HEK293T 细胞,再用双荧光素酶报告基因检测系统检验其转录活性。结果显示所获的il-11b启动子序列上存在3个潜在的启动子区和7个CpG岛,潜在的转录因子结合位点包括Sp1、CACCC-binding f、Egr-1、ICSBP、c-Jun、COUP、GR、RAP1、NF-kappaB、REV-ErbA alpha、ER、RAR-alpha1、RXR-beta、SRF、Oct-1、Oct-2、Pit-1a、GCN4、HNF-1、TBP、C/EBP alpha、HNF-1C、Oct-2.1、USF等,成功扩增出il-11b不同片段启动子,重组质粒双酶切检测条带大小一致,测序比对正确,双荧光素酶检测pGL3-il-11b、pGL3-il-11b-Δ1、pGL3-il-11b-Δ2、pGL3-il-11b-Δ3、pGL3-il-11b-Δ4、pGL3-il-11b-Δ5报告基因质粒的活性分别是pGL3–enhancer空载对照组的1.94、14.92、5.33、9.11、0.75、1.32倍。该结果为研究细胞因子参与的免疫相关信号之间的调控提供了有力的研究工具。     

斑马鱼Hoxa-11a基因克隆及序列分析

用PCR法从斑马鱼基因组DNA中扩增了Hoxa-11a基因的完整编码序列,并将其克隆到PCR-TOPO载体.该基因包括两个外显子,长度分别为622 bp和233 bp,其间的内含子为726 bp,共编码284个氨基酸.它与人、鼠、鸡、爪蟾和矛尾鱼Hoxa-11基因氨基酸序列的同源性分别为50.0%、51.3%、53.3%、56.7%和59.7%.除同源异型盒外,外显子Ⅰ区和内含子中也存在保守序列.外显子Ⅰ中丙氨酸同聚物与其两侧富含甘氨酸和丝氨酸亚区的积累是不同动物Hoxa-11基因长度变化的主要因素.     

白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析

本文利用SiteFinding-PCR方法克隆了白桦BpGT14基因起始密码子ATG上游2 169 bp序列,并通过PLACE启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明,该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件,同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的1 156 bp片段构建了pBpGT14∷GUS植物表达载体,利用农杆菌侵染的方法将pBpGT14∷GUS报告基因瞬时转化烟草植株,鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且在茎段处活性较高;进一步分析非生物胁迫对烟草中GUS酶活性的影响,表明该启动子对ABA、NaCl、PEG及高温处理均有明显响应,且对于NaCl及PEG处理响应迅速。为了更好的鉴定白桦BpGT14基因启动子在白桦细胞中的启动活性及响应模式,本文构建了pBpGT14∷GFP载体并瞬时转化白桦茎段悬浮细胞,进行研究。GFP转录水平分析结果与GUS酶活性结果基本一致,但其中部分时间点仍存在差异。选取PEG处理3、6、12及24 h的转GFP基因白桦茎段悬浮细胞,在显微镜下观察其绿色荧光蛋白,以此揭示该启动子对干旱的响应模式。结果表明,该启动子在白桦茎段悬浮细胞中启动了GFP的表达,在处理初期(3 h),荧光效果明显;随着处理时间的增加,细胞脱水明显,且在细胞壁表现高亮度荧光。      

水稻OsN1基因5’端启动子不同区域序列分析

为了研究水稻OsN1基因启动子(OsN1p)的表达调控机理,用OsN1基因ATG(ATG中的A为0)上游-1 089 bp、-881 bp、-489 bp和-245 bp的启动子序列分别取代pBI121中的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1.1p、pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2p。将这些表达载体经农杆菌介导转化水稻日本晴,获得转基因植株。对启动子的表达特点和启动活性进行了分析,结果表明,由-1 089 bp启动子、-881 bp启动子和-489 bp启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中表达,-245 bp启动子不能驱动gus基因在愈伤组织中表达,说明启动子OsN1p具有启动活性的最小启动序列为ATG上游的-489 bp;-489 bp启动子驱动的gus基因在转基因植株根中表达,在根冠不表达;用5 mmol/L水杨酸(SA)喷施转基因植株叶片后,GUS定量分析结果表明转基因植株的GUS活性增高,转-881bp启动子植株的GUS活性比转-1 089 bp启动子植株的活性高。可见,启动子OsN1p具有组织特异性表达和受SA诱导表达的特性。     

新疆3个不同品种牛SLC11A1基因启动子克隆及序列分析

[目的]溶质性载体蛋白家族成员1(SLC11A1)基因是一个主要的自然抗性候选基因,与多种胞内寄生病原菌的抵抗作用相关,研究克隆新疆褐牛、荷斯坦牛和西门塔尔牛SLC11 A1基因启动子序列,分析启动子序列差异,为奶牛抗病育种提供辅助选择的分子标记.[方法]分别采集新疆3个品种牛全血,提取基因组DNA,PCR扩增5'端启动子区,测序.利用生物信息学软件CpGplot、RepeatMasker、TFSEARCH、WWW SignalScan及双荧光素酶检测系统对获得序列进行分析.[结果]获得SLC11A1基因启动子片段1 463 bp,且具有启动子活性,未发现CpG岛的存在.新疆3个品种牛间SLC11A1基因启动子序列未出现差异,但与美国安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在4处差异.启动子区预测到SP1,NF1,RelA-p65,GKLF,CPBP等12个转录因子结合位点,并发现1个增强子区域(-734～-740),该序列存在两处短散的重复元件BOV-tA2、MIR3,以及重复DNA元件Charlie8.[结论]得到新疆地区3个品种牛SLC11A1基因启动子序列,并与安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在差异,为进一步研究SLC11A1基因多态性影响机体对胞内感染菌的抗性研究提供理论依据.     

水牛 STAT5a 和 STAT5b 基因启动子克隆及其活性分析

为了解转录激活与信号转导因子5(STAT5)在水牛乳腺发育及泌乳生理中的功能,对水牛STAT5a和STAT5b基因的5′调控区启动子序列进行了克隆,并比较其活性.根据GenBank已公布的牛STAT5a和STAT5b基因序列设计特异性引物,以广西本地水牛乳腺组织基因组DNA为模板,通过PCR法分别扩增不同长度STAT5a和STAT5b基因启动子片段并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的水牛STAT5a基因启动子片段(P1和P2)大小是500bp,700bp,STAT5b基因启动子片段(P3,P4和P5)大小是500bp,800bp,1 500bp.在线分析结果显示,仅P2片段中存在高甲基化位点,且富含SP1,AP2等转录因子结合位点.将构建的不同长度启动子片段分别连入pGL3-Basic载体,分别转染水牛乳腺上皮细胞,检测荧光素酶表达水平.与未转染组相比,P1~P5质粒转染组的荧光素酶比值均显著提高(p0.05);添加5mg/mL质量浓度催乳素(PRL)处理乳腺上皮细胞,P3质粒转染组的荧光素酶比值显著高于其他各组(p0.05).以上结果表明,水牛STAT5a和STAT5b基因启动子活性均受到PRL调节,两者表达水平在水牛乳腺上皮细胞中不同,且STAT5b基因表达受PRL调控更为明显.     

大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析

【目的】硫转运蛋白（sulfate transporter,SULTR）参与根系对外界环境中硫酸根（SO₄^2-）的吸收与转运。大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特异表达,其功能是将外界的SO₄^2-吸收转运到植物根系中。文章克隆大豆硫转运蛋白GmSULTR1;2b的启动子,研究该启动子的驱动活性和组织表达情况,从而了解GmSULTR1;2b的调控机制,为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析预测该基因上游2 259 bp为启动子,并利用在线数据库PLACE和Plant-CARE预测该启动子序列的调控元件。以大豆品种南农N2899的DNA为模板,进行普通PCR扩增,将克隆的启动子序列与GUS连接构建植物重组表达载体pSULTR1;2b∷GUS。利用冻融法将重组质粒转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导的遗传转化法转化大豆进行瞬时表达,以GUS为报告基因对启动子的活性进行分析。另外,将重组质粒转入发根农杆菌K599中进行大豆毛状根转化试验,借助于GUS报告基因,通过体视镜观察毛状根的横切面,分析启动子在根中的表达情况。最后以转化的阳性毛状根为材料,通过GUS酶活试验（GUS activity）分析启动子的活性。【结果】克隆大豆品种南农N2899的GmSULTR1;2b启动子与NCBI序列基本一致。通过在线预测分析启动子的调控元件发现该启动子具有真核生物启动子必须的核心元件TATA-box外,还含有激素应答元件ERE（乙烯响应元件）、ABRE（脱落酸响应元件）等,胁迫应答元件TC-rich repeats（干旱胁迫以及病虫害胁迫）、AT-rich element（AT-rich的DNA与蛋白结合位点）和MYB等。重组载体pSULTR1;2b∷GUS经PCR和测序鉴定,证实已构建成功。大豆瞬时表达后进行X-gluc染色显示,重组载体侵染的大豆显蓝色,说明GmSULTR1;2b启动子能够驱动下游GUS的表达。对转化的毛状根染色之后,体视镜下观察阳性根的横切面,发现GUS主要在根毛、根表皮和中柱内表达,表明GmSULTR1;2b启动子主要在根毛、根表皮和中柱内表达。对转化毛状根进行GUS酶活试验（GUS activity）说明该启动子的启动活性比CaMV35S启动子的启动活性弱。【结论】克隆了GmSULTR1;2b启动子序列,该启动子具有驱动下游GUS的表达的功能,而且该启动子在根毛、根表皮和中柱内表达。     

水稻强分蘖基因MT1启动子的克隆及与GUS、GFP融合基因的构建

[目的]研究MT1启动子的功能。[方法]通过转基因植株中MT1启动子指导外源基因GUS及GFP的表达。[结果]研究克隆了MT1启动子,并将启动子区与报告基因GUS及GFP的编码区融合。[结论]利用MT1启动子与GUS、GFP构建融合基因,能够用于研究启动子功能。     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P<0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P>0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P<0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

木薯MeSSSIV基因启动子克隆及序列分析

木薯是热带典型的高淀粉、抗逆、抗旱作物.可溶性淀粉合成酶(SSS)是植物淀粉合成过程中的关键酶之一.根据已发表的拟南芥SSSⅣ基因序列,通过同源比对从木薯AM560、KU50基因组中获得木薯MeSSSⅣ基因的cDNA序列以及该基因部分启动子序列,设计特异引物,从木薯栽培种KU50基因组DNA中克隆了MeSSSⅣ基因系列1068 bp(该序列包含978 bp的启动子调控序列及90 bp的基因编码序列).序列分析表明,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、激素和光响应相关的顺式作用元件,特别是发现CGACGOSAMY3、DOFCOREZM、SREATMSD、SURE等与糖信号相关的重要顺式元件,这些元件预示MeSSSⅣ基因的表达可能与糖信号相关.以上结果说明,MeSSSⅣ可能参与木薯多种代谢过程,其表达可能受多种调控因子的调节.     

胡萝卜sⅡ基因启动子克隆及序列分析

克隆胡萝卜直根特异性表达的液泡转化酶Ⅱ型同工酶(sⅡ)基因启动子序列,为实现外源基因在胡萝卜直根特异性表达做准备。从天红五寸参胡萝卜叶片中提取总DNA,采用PCR扩增方法获得sⅡ基因启动子序列,然后结合5'RACE实验方法和生物信息预测方法对sⅡ基因启动子进行序列特征分析。结果表明:从胡萝卜基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段,序列分析表明该启动子序列与已发表的序列具有99.6%的同源性;试验确定了该启动子的转录起始位点位于翻译起始位点上游26bp处的“A”;生物信息学预测该启动子的核心序列及上游增强子序列、抑制子序列、根特异性序列及受病原菌、损伤、干旱、ABA激素调控序列等顺式作用元件。成功克隆并序列分析了胡萝卜直根特异性表达的sⅡ基因启动子,为该启动子在植物基因工程中的应用奠定基础。     

植物凝集素SMLII 基因启动子的克隆及序列分析

根据已克隆的丹参植物凝集素SMLII基因cDNA序列,利用染色体步移技术克隆出SMLII 启动子区序列,并进行生物信息学预测分析该基因的功能,结果得到了该基因上游1023 bp的启动子序列（GenBank AccessionNo: KF193867）。分析表明,在该序列中不但含有真核生物典型的核心启动子区TATA-box、CAAT-box,而且含有一些特有的上游启动子元件ABRE、ARE、ASF1MOTIFCAMV、HSE、IBOXCORE、WBOXATNPR1等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。     

百合LhTPS基因启动子的克隆及序列分析

为明确百合LhTPS基因的启动子序列特征,利用反向PCR技术和DNAMAN、PlantCARE等分析软件,对8个不同百合品种萜烯合酶基因LhTPS的启动子进行克隆和生物信息分析。结果表明:1)克隆得到的LhTPS基因启动子序列长度在1 376~1 414 bp,相似性为90.26%,核苷酸多态性位点404个,大于5 bp的插入缺失有6处;2)不同百合品种的LhTPS启动子序列均包括核心元件和应答元件,应答元件又分为生长发育、光响应、胁迫响应及激素响应4类,其中与MeJA反应相关的顺式作用元件(CGTCA-motif、TGACG-motif、MYC和MYB)所占比例最大;3)根据启动子序列信息,可将8个百合品种分为4组,即东方百合组、亚洲百合组、喇叭百合组和东喇百合组,分类结果与传统分类结果一致。综上,LhTPS基因启动子序列的首次获得,为日后进行LhTPS启动子活性和功能分析奠定了基础,也为阐明百合萜类挥发物形成的调控机制奠定了理论基础。     

木薯MeSSSⅣ基因启动子克隆及序列分析

木薯是热带典型的高淀粉、抗逆、抗旱作物。可溶性淀粉合成酶（SSS）是植物淀粉合成过程中的关键酶之一。根据已发表的拟南芥SSS郁基因序列,通过同源比对从木薯AM560、KU50基因组中获得木薯MeSSS郁基因的cDNA序列以及该基因部分启动子序列,设计特异引物,从木薯栽培种KU50基因组DNA中克隆了MeSSS郁基因系列1068bp（该序列包含978 bp的启动子调控序列及90bp的基因编码序列）。序列分析表明,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、激素和光响应相关的顺式作用元件,特别是发现CGACGOSAMY3、DOFCOREZM尧SREATMSD、SURE等与糖信号相关的重要顺式元件,这些元件预示MeSSS郁基因的表达可能与糖信号相关遥以上结果说明,MeSSS可能参与木薯多种代谢过程,其表达可能受多种调控因子的调节。     

2个水稻PLT基因启动子的克隆及其表达分析

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。     

5种壁虎科动物Cyt b基因的序列分析

以红斑大壁虎、黑斑大壁虎、蹼趾壁虎和中国石龙子为材料,采用改进的SDS/蛋白酶K裂解法提取DNA,用特异引物进行PCR扩增线粒体Cyt b基因部分序列,PCR产物经纯化后,进行序列测序。用邻接法和最大简约法构建了其系统发育关系,结果显示红斑大壁虎和黑斑大壁虎首先聚在一起,再先后与同为壁虎属的蹼趾壁虎和白脊壁虎相聚,然后与同为壁虎科的沙虎相聚,最后与石龙子科的中国石龙子相聚。     

大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析

GmeR是一种植物酶学抗病基因,编码的蛋白质具有丝氨酸乙醛酸转氨酶(SGT)活性,受水杨酸诱导.与大豆霜霉病抗性密切相关.为了进一步研究GmeR基因的抗病机理,我们利用染色体步移技术克隆得到长为1 036 bp的GmeR基因5'上游片段.序列分析显示此片段舍有典型的TATA-box、CAAT-box、G-box和as-...