水牛唾液蛋白胃蛋白酶解产物中总阿片样生物活性的测定

研究唾液中的生物活性物质是受人注目的领域。许多研究表明 ,唾液中除含有多种激素和细胞因子外 ,还含有丰富的蛋白质。这些蛋白质(特别是粘蛋白)含有脯氨酸富集片段 ,这些片断抵抗蛋白酶的水解。因而推测 ,唾液进入消化道后有可能解放一些活性肽段。本试验旨在探讨唾液蛋白经胃蛋白酶水解是否有阿片样活性物质产生。自5头体重(450±50kg)公水牛口腔采集混合唾液 ,测定蛋白含量。加入胃蛋白酶 ,在 pH1.4 ,39℃孵育2小时后 ,将酶灭活。以孵育前将酶灭活作对照。调 pH7.2,8500×g离心30分钟。取上清液和1640培养液各5ml与生长旺盛的NG108 -15细胞一起在37℃孵育15分钟。收集细胞 ,提取细胞内cAMP,放免测定cAMP的含量。发现NG108 -15细胞膜上有丰富的阿片受体 ,受体激活后可引起细胞内cAMP减少 ,这种作用可被特异性的阿片受体阻断剂纳洛酮(Nal)反转。因此 ,本试验对照组与试验组分别作加Nal和不加Nal2种处理 ,以细胞cAMP与胞浆蛋白比值变化判定酶解液是否具有阿片样生物活性。试验结果表明 ,试验组细胞cAMP含量 :不加Nal显著低于加Nal(20.103±2.473)ng/mg蛋白质vs(25.850±2.461)ng/mg 蛋白质(P<0.01) ;对照组不加Nal差异不显著(27.177±3.738)ng/mg 蛋白质vs(27.337±3.461)ng/mg 蛋白质(P>0.05)。结果表     

牛奶中6种磺胺类药物残留的HPLC分析方法研究

本文对反相高效液相色谱仪(HPLC)分析牛奶中6种磺胺类药物(SAs)残留的样品前处理方法和色谱条件进行优化。结果表明:采用乙腈提取SAs残留,用正己烷液-液分配(除去脂溶性物质)和碱性氧化铝SPE柱净化,UV270nm检测,在0.01￣8.0μg/mL浓度范围内,各药物峰面积与药物浓度之间呈良好的线性关系(R2=0.999);平均添加回收率均在80%以上,变异系数在6%以下。SD、SM2、SMD、SMZ、SD M和SQ X的检测限分别为2.30、3.16、3.60、5.42、11.76 ng/mL和15.66 ng/mL。     

厄贝沙坦及其复方制剂中痕量杂质N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸残留方法学研究

采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)建立厄贝沙坦及其复方制剂中N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)的测定方法。采用Waters ACQUITY UPLC○RHSS T3色谱柱进行分离,以0.005 mol/L甲酸铵(用甲酸调pH值至3.0)为流动相A,甲醇为流动相B,梯度洗脱,质谱检测器,流速为0.3 mL/min。结果显示NMBA的线性范围为0.156 6~3.132 6 ng/mL,相关系数r>0.99,方法检出限浓度为0.047 0 ng/mL(相当于样品浓度0.01μg/g),定量限浓度为0.156 6 ng/mL(相当于样品浓度0.03μg/g),样品加标回收率在80%~130%。说明该方法可以快速、简便、灵敏、准确地测定厄贝沙坦及其复方制剂中NMBA含量。     

气相色谱-质谱联用法测定瘤胃液中的甲酸和其他6种挥发性脂肪酸

本试验旨在建立一种测定瘤胃液中甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的气相色谱-质谱联用方法。样品选用湘东黑山羊和荷斯坦奶牛的瘤胃液,18000 r/min离心10 min,取上层清液。将上层清液与25%的偏磷酸按照9∶1(v∶v)的比例混合均匀,静置0.5 h后,4℃条件下18000 r/min离心10 min,取上清液过0.22μm滤膜,进行气相色谱-质谱分析。以DB-FFAP毛细管柱进行分离,甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸在9 min内达到基线分离。结果表明:这7种组分色谱峰保留时间的相对标准偏差均小于0.5%,峰面积的相对标准偏差均小于5.0%。甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸分别在0.8~121.0μg/mL、0.3~3081.0μg/mL、0.4~1165.2μg/mL、0.4~275.1μg/mL、0.2~543.0μg/mL、0.5~129.9μg/mL和0.4~271.5μg/mL内线性关系良好,线性相关系数均达到0.998以上,检出限(3倍信噪比)在0.069~0.252μg/mL。山羊和奶牛瘤胃液样品的加标回收率分别为91.8%~103.8%和78.7%~95.2%。本试验建立的测定瘤胃液中甲酸以及其他6种挥发性脂肪酸的气相色谱-质谱联用方法选择性强、样品用量少、操作简单,可为反刍动物瘤胃碳水化合物代谢及甲烷生成的相关研究提供技术支撑。     

液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定液态乳中黄曲霉毒素M_1含量

本研究建立了液态乳中黄曲霉毒素M1的液相色谱-三重四级杆串联质谱测定方法。在定量称量的样品中加入乙腈直接稀释定容,经过涡旋振荡,在高速冷冻离心机上离心,将离心后的上清液过针式过滤器过滤,然后直接注入液相色谱串联质谱仪中进行检测。利用ESI源(正离子模式)、C18液相色谱柱以及SRM方法对样品中的黄曲霉毒素M1进行定性、定量分析。该方法测定结果的相对标准偏差小于7%(n=6),平均回收率大于85%,线性范围为1～10ng/mL,最低检出限为0.011ng/mL。     

UPLC-MS/MS检测猪肉中的地西泮及其代谢物

采用超高效液相色谱串联质谱联用仪分析猪肉的地西泮、去甲羟地西泮和去甲地西泮.猪肉先经过β-盐酸葡萄糖醛苷酶水解,然后用乙酸乙酯振荡提取酶解液,分离上层有机溶剂并蒸干,用乙腈溶解残渣,溶液过滤后用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)进行检测.通过对提取方式和液相色谱分离条件的优化,建立猪肉中地西泮、去甲羟地西泮和去甲地西泮的UPLC-MS/MS检测方法.方法中空白样品的加标回收率为80.8%~90.3%,相对标准偏差(RSD)在5.9%~13.4%,定量限为1.0μg/kg.     

高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中地克珠利的含量

建立了一种测定饲料中地克珠利的高效液相色谱-串联质谱方法。以乙腈提取样品中的待测物,正己烷除脂,离心后用高效液相色谱-串联质谱仪,选择多反应监测(MRM)、负离子模式进行定性和定量分析。结果表明,地克珠利在0.5~100 ng/m L浓度范围内线性关系良好,线性相关系数≥0.999,检出限为0.1μg/kg,定量限为0.5μg/kg。地克珠利在0.5、1和5μg/kg三个添加水平下,三种饲料的平均加标回收率在79.2%~94.5%之间,相对偏差在1.7%~14.3%之间。本方法抗干扰能力强,操作简便,灵敏度高,适用于饲料中地克珠利的测定。     

桑叶次生代谢产物分析

通过色谱分离与波谱鉴定,对桑叶次生代谢产物进行了研究。分离并鉴定了10个化合物:5,7-二羟基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5,7-d ihydroxycoum arin-7-O--βD-glucopyranoside,1);5,2,′4′-三羟基黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5,2,′4-′trihydroxyflavone-7-O--βD-glucopyranoside,2);东莨菪苷(scopolin,3);丁二酸(butaned ioic,4);3,4-二羟基苯甲酸(3,4-d ihydroxybenzoic ac id,5);山柰酚-3-O-(6″-O-2-丁烯酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷[kaempferol-3-O-(6″-O-2-butenoyl)--βD-glucopyranoside,6];山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol-3,7-d i-O--βD-glucopyr-anoside,7);尿嘧啶(urid ine,8);胸腺嘧啶(thym ine,9);D-半乳糖醇(D-galactitol,10)。其中化合物5-10为首次从桑属植物中分离得到;化合物2为新天然产物;化合物1为新化合物。     

同位素内标法测定鸡蛋中金刚烷胺残留

采用同位素内标法建立了鸡蛋中金刚烷胺残留液相色谱-串联质谱方法。样品经酸性乙腈提取正己烷液液分配去脂净化后上机测定。色谱柱为C_(18)(50mm×2.1mm,1.7μm),以0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾正离子(ESI+)和多反应监测(MRM)模式测定,同位素内标法定量。结果表明,金刚烷胺进样浓度在2～200ng/ml浓度范围内呈良好的线性关系(r~2=0.9998);方法检出限和定量限分别为1μg/kg和3μg/kg;3、6、30μg/kg3个添加水平下,回收率在87.48%～98.15%之间,批内、批间相对标准偏差均小于5%。本方法简便、准确、快速、灵敏,适用于鸡蛋中金刚烷胺残留检测。     

高效液相色谱串联质谱法检测家禽组织中氯霉素残留量的研究

为了检测氯霉素在家禽组织中的残留量,本文建立了一种超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。通过对肌肉和鸡蛋样品采用碱性乙酸乙酯提取,20%甲醇水饱和正己烷液萃取净化,对鸡的肝脏和肾脏样品采用β-葡萄糖醛酸苷酶酶解后采用乙酸乙酯提取,C18固相萃取柱(500mg/3cc)净化,进行液相色谱-串联质谱负离子模式测定。结果表明,氯霉素在0.5~10.0ng/mL范围内均呈现良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.990;样品中氯霉素的检测限为0.1μg/kg,定量限为0.2μg/kg。UPLC-MS/MS对氯霉素在0.2、0.4、2μg/kg范围内的平均回收率均为70%~120%,相对标准偏差均小于20%。     

应用荧光RT-PCR技术检测口蹄疫病毒

1　材料与方法1.1　试剂　裂解液 ,DEPC水、carrier RNA、RT-PCR反应液 ,RT- PCR酶颗粒 (Beads)、Taq酶。均由深圳匹基生物工程股份有限公司提供。1. 2　引物设计　上游引物 :5′- TCCACTAGC-GAGTGTTAGTAGC- 3′;下游引物 :5′- GCCTGT-CACCAGTGTTTGAGTA- 3′。1.3　试验材料　进口冻肉、冻猪脚、冻猪耳等。1.4　仪器　荧光 PCR仪 ,L ight cycler(Roche公司生产 )。1.5　操作方法1.5 .1　样本处理　 (1)取 n个 1.5 ml灭菌离心管 (n=样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照 ) ,作好标记。 (2 )在各离心管中加入 6 0…     

GST-甘油-3-磷酸脱氢酶的分离及纯化

为了解重组酿酒酵母GCY1基因表达甘油-3-磷酸脱氢酶的情况,试验采用SD-URA 2%半乳糖、3×YP+6%葡萄糖、SC-URA 2%半乳糖、SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl 4种培养基诱导培养粉碎破壁酵母,采用蛋白质全自动高速纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子量。结果表明:含有GCY1基因的酿酒酵母在25℃下振动培养48 h其3×YP+6%葡萄糖培养物的OD600值为8.75,SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl培养物的OD600值为7.35。采用Profinia低压液相色谱纯化,只有SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl培养基中酿酒酵母表达了甘油-3-磷酸脱氢酶,且经SDS-PAGE凝胶电泳测得分子质量为65 ku。     

牛肉组织中玉米赤霉醇及相关物残留的气相色谱-质谱法测定

建立了能够同时检测牛肉组织中玉米赤霉醇（又名α-玉米赤霉醇）及3种相关物（β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇）残留的气相色谱-质谱联用法。样品均质后,用甲醇提取样品中的待测物,浓缩,用水稀释后,乙酸乙酯萃取,浓缩。用氢氧化钾溶液溶解,正己烷去脂,乙醚萃取,氨基固相萃取柱净化,衍生化后,用气相色谱-质谱联用仪检测,外标法定量。玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇线性范围均为0.5-10.0 ng/mL,检测限均为1.0 ng/g,在添加5.0 ng/g时,回收率为71.5%-81.4%,变异系数为1.4%-5.0%。     

重组酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶的诱导与纯化

为了解重组酿酒酵母GCY1基因表达甘油-3-磷酸脱氢酶的情况,以SD-URA 2%葡萄糖、3×YP+6%半乳糖、SC-URA 2%半乳糖和SC-URA2%半乳糖加5%1 M Na Cl等4种培养基诱导培养,粉碎破壁酵母,采用Profinia蛋白质全自动高速纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子质量。结果显示:含有GCY1基因的酿酒酵母在25℃下振动培养48 h,其OD600 nm吸光值:3×YP+6%半乳糖培养物OD值为8.75,而3×YP+2%半乳糖+5%1 M Na Cl培养物OD值为7.35。采用Profinia低压液相色谱纯化,只有3×YP+2%半乳糖+5%1 M Na Cl培养基中酿酒酵母表达甘油-3-磷酸脱氢酶,且经SDS-PAGE凝胶电泳测得分子质量为65 ku。     

鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留的UPLC-MS/MS检测方法研究

为建立鸡蛋中硝基呋喃类代谢物(AOZ、AMOZ、AHD和SEM)残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法(UPLC-MS/MS),采用内标法定量,样品在酸性条件下衍生化后,弱碱性条件下用乙酸乙酯提取后,用正己烷去除脂肪,高速离心去除蛋白质等杂质,上机测试。液相色谱条件:色谱柱为BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相为甲醇+10 mmol/L乙酸铵水溶液,梯度洗脱,流速为0.3m L/min,柱温为30℃,进样量为10μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI+),多反应监测(MRM)方式进行采集。结果表明:硝基呋喃类代谢物在0.5~20 ng/mL浓度范围内均呈现良好的线性关系,相关系数(R2)均大于0.990。鸡蛋中四种代谢物的检测限均为0.25 ng/g,定量限均为0.5 ng/g。在0.5、1和5 ng/g三个添加浓度平均回收率为79.1%~109.4%,批内和批间RSD均小于20%。该方法具有简便快捷、灵敏度高、定性准确等特点。     

高效液相色谱荧光检测法检测Beagle犬血浆中伊维菌素的试验

建立一种灵敏、简便、可重复的高效液相色谱检测方法检测Beagle犬血浆中伊维菌素(Ivermectin,IVM)的含量。样品中加入内标多拉菌素(DRM),采用乙腈提取,涡旋振荡后高速离心,上清液于60℃N2吹干,衍生化后进样分析。色谱柱为ODS-2 Hypesil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),检测器为荧光检测器,流动相为甲醇-乙腈-0.2%乙酸(55∶43∶2,V/V/V),流速为1 mL/min,激发波长365 nm,发射波长475 nm,柱温为35℃。测得DRM的保留时间为8.9 min,IVM保留时间为10.7 min。在0.25 ng/mL¹20 ng/mL的范围内,血浆药物浓度与峰面积之比呈良好的线性关系,其线性方程为:y=5.34e-003x+2.86e-003(n=10,R2=0.9998)。120 ng/mL、10 ng/mL、0.25 ng/mL三个浓度的添加回收率为83.01%120 ng/mL的范围内,血浆药物浓度与峰面积之比呈良好的线性关系,其线性方程为:y=5.34e-003x+2.86e-003(n=10,R2=0.9998)。120 ng/mL、10 ng/mL、0.25 ng/mL三个浓度的添加回收率为83.01%⁹1.75%,日内变异系数为3.75%91.75%,日内变异系数为3.75%⁶.45%,日间变异系数为3.26%6.45%,日间变异系数为3.26%⁸.86%,最低检测限为0.05 ng/mL。本方法操作简便,灵敏度高,可应用于Beagle犬血浆中伊维菌素的检测。     

气相色谱-串联质谱法测定豆乳中12 种有机磷及氨基甲酸酯类农药残留

建立QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定豆乳中12 种有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的方法。样品经乙腈提取，柠檬酸盐缓冲条件下分离，无水硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶和C18净化处理，气相色谱-串联质谱仪测定。结果表明：12 种农药的定量限均为0.004 mg/kg；标准曲线在5～200 ng/mL范围内线性良好，相关系数＞0.99；进行3 个不同水平的加标实验，加标回收率为71.8%～114.9%，相对标准偏差为4.6%～13.3%。该方法快速、高效、准确，可用于豆乳中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的测定。     

黄芩多糖的提取及结构表征

【目的】优化水提醇沉法提取黄芩多糖最佳工艺条件,提高黄芩多糖提取率,并探究黄芩多糖的结构,为工业化提取黄芩多糖提供依据。【方法】采用单因素试验考察提取时间、提取温度、料液比和提取次数对多糖提取率的影响。运用Box-Behnken中心组合试验设计法,选取提取时间、提取温度、料液比和提取次数为优化的4个因素,以多糖提取率为响应值,设计4因素3水平试验方案,通过响应面分析确定水提醇沉法提取黄芩多糖的最佳条件;采用柱层析法对多糖进行分离纯化,采用红外光谱、紫外光谱、高效液相色谱(HPLC)、凝胶色谱对黄芩多糖的基团、纯度、分子质量和单糖组成进行分析。【结果】经响应面分析确定当提取温度为98℃,料液比为1∶12.40(g/mL),提取时间为138 min,提取次数为4次时,黄芩粗多糖提取率为12.23%。用DEAE-52纤维素柱层析分离和葡聚糖G-100凝胶柱层析进行纯化,得到Hq-3-1组分。凝胶渗透色谱分析表明,其Hq-3-1为均一多糖,分子质量为58 794 u。HPLC法柱前衍生化分析Hq-3-1组分的单糖组成结果显示,其包含果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖。紫...     

HPLC-ECD对尿中10种大环内酯类抗生素的多残留检测

本文建立了以库仑检测器(ECD)结合高效液相色谱(HPLC),同时对红霉素(ERY)、地红霉素(DIR)、泰乐菌素(TYL)、替米考星(TILM)、螺旋霉素(SPI1)、交沙霉素(JOS)、吉他霉素(KIT)、玫瑰霉素(ROS)、罗红霉素(ROX)和竹桃霉素(OLE)等10种常用大环内酯类抗生素的多残留检测方法。样品前处理采用叔丁基甲醚进行液液萃取,收集有机相经氮气吹干后用流动相溶解进行HPLC分析,用C8反相柱梯度洗脱,10种药物得到了最佳分离。采用ROX作为内标物定量,所有药物的检测限均低于2.5ng。标准曲线采用基质法制备。尿液中每种药物的检测限均低于3ng(相当于尿液中起始浓度低于0.06mg/L)。回收率在低浓度水平时为49.9-81.2%,而高浓度水平时为53.2-92.0%。     

液相色谱-串联质谱法检测牛奶中的四环素类药物

本文以液相色谱-串联质谱法检测牛奶中的四环素类药物残留,试料中残留的四环素、土霉素、金霉素和多西环素经Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取,HLB柱净化。用液相色谱-串联质谱法测定,外标法定量。经实验,制得10、20、50、100、200、500 ng/m L的系列标液。以系列标液浓度为横坐标,对应峰面积为纵坐标进行线性回归,四环素、土霉素、金霉素和多西环素在10~500 ng/m L范围内呈现良好的线性关系,R2均大于0.990。四环素、土霉素、金霉素和多西环素在牛奶中的检测限为5 ng/g,定量限为10 ng/g。在10~200 ng/g添加浓度的回收率为70%~120%。批内变异系数≤20%,批间变异系数≤20%。