两种牛蛙活性肽结构及体外抗肿瘤细胞增殖作用的研究

试验旨在研究新发现的两种牛蛙活性肽对人肺癌细胞NCI-H446、人乳腺癌细胞MCF-7及小鼠白血病细胞K562 3种肿瘤细胞体外增殖的影响,为新的多肽抗肿瘤药筛选提供依据。本试验利用圆二色谱(CD)法检测两种新牛蛙活性肽的二级结构,通过MTS细胞毒试验测定不同浓度的两种新牛蛙活性肽对人肺癌细胞NCI-H446、人乳腺癌细胞MCF-7及小鼠白血病细胞K562 3种瘤细胞体外增殖的影响。圆二色谱法结果显示,Temporin-Lb的二级空间结构为聚脯氨酸Ⅱ型螺旋(PPⅡ)结构,Catesbeianin-1a的二级空间结构为无规则卷曲。MTS细胞毒试验结果显示,给予Catesbeianin-1a的3种瘤细胞培养24 h后,瘤细胞形态无明显变化,正常增殖,而给予Temporin-Lb的3种瘤细胞培养24 h后,瘤细胞发生皱缩、细胞变圆、脱落甚至死亡,增殖受到抑制,其中对Temporin-Lb在4~40 μmol/L浓度范围内对小鼠白血病细胞K562的抑制效果最为明显。结果表明,新牛蛙活性肽Temporin-Lb具有一定的抑瘤作用,Catesbeianin-1a对瘤细胞的体外增殖没有明显影响。     

光滑爪蟾皮肤抗菌肽的分离纯化及活性检测

通过高效液相色谱法,对光滑爪蟾皮肤分泌物进行分离纯化,得到具有抗菌活性的光滑爪蟾皮肤抗菌肽。通过最小抑菌浓度（MIC）试验、溶血活性试验及癌细胞抑制试验,对其体外生物活性进行研究。结果表明,经过纯化得到2个纯度高且具有活性的抗菌肽（AMP1和AMP2）,质谱鉴定结果得出其相对分子质量分别为1 082.78和2237.34。MIC结果表明,AMP1对S.aureus ATCC25923、Escherichia coli ATCC25922的MIC值分别为23.63、8.71mg/L,对MRSA无抑菌作用。AMP2对S.aureus ATCC25923,Escherichia coli ATCC25922、MRSA的MIC值分别为4.94、10.7、86.6mg/L。溶血试验显示AMP1,AMP2具有极弱溶血活性,且对癌细胞SW480具有抑制作用。     

新牛蛙抗肿瘤肽RGD-T-La(FS)嵌合体的设计及其抗肿瘤作用

为了研究新牛蛙抗肿瘤肽RGD-嵌合体的抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞的作用机制。本研究以新牛蛙抗菌肽Temporin-La(T-La)为基序,通过生物信息学分析,改变特定氨基酸残基设计合成新的抗肿瘤肽Temporin-La(S)(TLa(S))和Temporin-La(FS)(T-La(FS)),氨基端偶联RGD肽成RGD-T-La、RGD-T-La(S)和RGD-T-La(FS)抗肿瘤肽,通过圆二色谱检测多肽二级结构,MTT法体外筛选抗肿瘤细胞活性多肽。使用流式细胞仪测定不同肿瘤细胞对不同多肽的吸收量,筛选对抗肿瘤肽敏感的肿瘤细胞。利用激光共聚焦显微镜实时观察抗肿瘤活性强的抗肿瘤肽对敏感肿瘤细胞的杀伤作用,并用扫描电镜观察抗肿瘤肽及其RGD嵌合体肽对肿瘤细胞的作用机制。在新牛蛙抗菌肽Temporin-La基序上设计T-La(S)和T-La(FS)2种抗肿瘤活性肽,圆二色谱仪测定其二级结构均呈α螺旋型,MTT结果显示黑色素瘤细胞(B16)对几种多肽的敏感性最强,10 mg/L质量浓度时,RGD-T-La(FS)对B16的毒性作用最强,细胞存活率为24.65%。激光共聚焦显微镜实时观察到,RGD-La(FS)和RGD-La(S)对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。扫描电镜结果显示,RGD嵌合体多肽对肿瘤细胞的杀伤作用具有位点靶向性。流式细胞仪检测HepG2对FITC-RGD-T-La(FS)的吸收量最大,检测到荧光强度为800 950.70。经改造的多肽T-La(FS)可以增加其对肿瘤细胞的杀伤作用,且偶联RGD的嵌合体RGD-T-La(FS)对肿瘤细胞的杀伤作用更具有靶向专一性,为抗肿瘤肽作为抗肿瘤药物的临床应用提供科学依据。     

42种常见中药对猪链球菌的体外抑菌试验

为了观察中药对猪链球菌的体外抑菌效果,试验将所选的42种常见中药按照常规法制备水提物,采用平板打孔法和试管二倍稀释法测定中药水提物对猪链球菌的体外抑菌作用。结果表明:在42种中药中有29种中药对猪链球菌有一定的抑菌作用,其中黄连水提物的抗菌活性最强,MIC为0.98 mg/m L;其次是黄柏、黄芩、丹参,MIC为3.91 mg/m L;有13种中药对猪链球菌无抑菌作用。说明不同中药对猪链球菌有不同的抑菌作用,其中黄连、黄柏、黄芩等抗菌活性较强的中药可进一步用于研究。     

小花棘豆生物碱对表皮葡萄球菌的抗菌作用及生物膜形成的影响

探讨小花棘豆生物碱对表皮葡萄球菌的抗菌作用及其对细菌生物膜的抑制作用。以表皮葡萄球菌为研究对象,通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),微量板半定量法测定其对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,以去离子水和氯化钠检测小花棘豆生物碱对细菌细胞壁的渗透能力影响。结果表明,小花棘豆生物碱对表皮葡萄球菌的抑菌作用较强,其MIC和MBC分别为1.6mg/mL和3.2mg/mL,1~1/4MIC的小花棘豆生物碱可明显抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,而且1~1/8MIC的小花棘豆生物碱对表皮葡萄球菌细胞壁的渗透能力有一定的影响。说明小花棘豆生物碱对表皮葡萄球菌具有抗菌作用,对其生物膜形成具有明显的抑制作用。     

基于天蚕素A和胡蜂毒素的杂合肽设计及活性鉴定

为了进一步改善胡蜂毒素（mastoparan,MP）的抗菌、抗肿瘤活性并减少细胞毒性,本研究通过分子杂合方法对其进行改造,并初步鉴定设计的杂合多肽的生物活性。以天蚕素A的N-端1-8序列片段和胡蜂毒素的保守序列为模板进行杂合设计,获得一条新型杂合肽KL-21。以胡蜂毒素MP-L作为参照,采用生物信息学方法、微量倍比稀释法、杀菌动力学方法、溶血试验、CCK-8法分别对KL-21和MP-L进行理化参数分析、结构预测、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定、杀菌动力学研究、溶血活性测定及肿瘤细胞毒性试验。结果表明,KL-21可以在短时间内迅速杀灭细菌,对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性菌（大肠杆菌）的MIC均为4~8 μg/mL,MBC均为8~16 μg/mL;KL-21对真菌（白色念珠菌）的最小MIC为32 μg/mL,MBC为64 μg/mL。兔红细胞溶血试验表明,KL-21在128 μg/mL时溶血活性仅为20%,较MP-L的溶血活性明显降低。细胞毒性试验表明,KL-21对肺癌细胞A549具有良好的抑制作用,16 μg/mL的体外抑制率达86%。研究表明,新型杂合肽KL-21较MP-L的抗菌和抗肿瘤活性有较大提高,细胞毒性显著降低,可以作为先导肽进一步研究和开发。     

双峰驼乳中乳铁蛋白的体外抗菌活性及影响因素

采用试管二倍稀释法测定了双峰乳中驼乳铁蛋白(CLF)的抗菌活性.结果表明,CLF对大肠埃希菌的最小抑菌浓度(MIC)为3 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2 mg/mL,与溶菌酶联合应用,则能明显增强其抗菌作用.CLF的抗菌活性还与其铁饱和度密切相关,随着铁饱和度的增加其抗菌活性明显下降.葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素和硫酸铵在0 mg/mL～10 mg/mL的质量浓度范围内,对CLF的抗菌活性影响不大.而NaCl或KCl的浓度为25 mmol/L～100 mmol/L,MgCl2或CaCl2的浓度为1.0 mmol/L～5.0 mmol/L时,CLF的抗菌活性则会明显降低.经较低温度加热处理后CLF能很好的保持其活性;而经较高温度加热处理会使CLF变性并失去抗菌活性.不同pH条件下的抗菌试验结果表明,当pH在7.5～8.0时CLF的抑菌效果最好.     

利福昔明对奶牛乳房炎常见病原菌的体外抗菌活性试验

旨在测定利福昔明对奶牛乳房炎常见病原菌的体外抗菌活性。采用琼脂二倍稀释法测定利福昔明对奶牛乳房炎常见病原菌大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌的最小抑菌浓度（MIC）。结果显示,利福昔明对19株大肠杆菌的MIC值为8~16μg/m L,对25株葡萄球菌的MIC值为0.002~0.06μg/m L,对18株链球菌的MIC值为0.06~2μg/m L。大部分临床分离菌的MIC值与标准菌的相近,表明分离菌株对利福昔明较为敏感,提示利福昔明对奶牛乳房炎常见病原菌具有较强的体外抗菌活性。     

6味中药对奶牛乳腺炎病原菌体外抗菌活性的比较

通过比较分析大黄、虎杖、丹参、地榆、甘草和银杏叶对奶牛乳腺炎病原菌体外抗菌活性的强弱,为其在抗感染疾病中的临床运用及抗菌中药的筛选提供科学依据。用琼脂平板二倍稀释法测定大黄、虎杖、丹参、地榆、甘草和银杏叶对15个种属33种120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌浓度,结合SPSS 17.0软件中单因素方差分析法以及同种属菌株MIC50和MIC90的统计分析,比较6味中药体外抑菌活性的强弱。结果:大黄、虎杖、丹参、地榆、甘草和银杏叶6味药物对革兰阳性菌的抗菌活性强于对革兰阴性菌的活性,6味受试药以地榆的抑菌活性最强,对120株奶牛乳腺炎病原菌均有较强的体外抗菌活性,MIC为0.39～6.25 mg/mL。而大黄、虎杖、丹参、甘草和银杏叶的抑菌活性强弱因菌株种属差异而明显不同,对于阳性菌,总体以甘草的抑菌活性最强,其次为丹参、大黄和虎杖,最差为银杏叶;对于阴性菌,相对抑菌活性最好的是丹参,其次为大黄和虎杖,再次为银杏叶,抑菌活性最差的是甘草。研究表明地榆和丹参体外具有较强的广谱抗菌活性。     

大黄芩鱼泡腾片对虾池病原菌的体外抗菌活性研究

为研究自制大黄芩鱼泡腾片对养虾池中分离菌株的体外抗菌活性，试验采用鉴别培养、生化反应、PCR方法鉴定菌株，并用微孔-平板法测定体外抑菌活性。结果显示：具有致病性的菌株有副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus，V.p）、弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii，V.f）和泛菌属的Pantoea eucrina（P.e）。大黄芩鱼泡腾片对V.p的MIC和MBC均为1 mg/mL|对V.f的MIC为4 mg/mL、MBC为8 mg/mL|对P.e的MIC和MBC均为4 mg/mL。由此表明，大黄芩鱼泡腾片对副溶血弧菌有较好的体外抗菌活性。 [关键词] 大黄芩鱼散|泡腾片|抗菌活性     

Design and Activity Identification of Hybrid Peptide Based on Cecropin A and Mastoparan

In order to further improve mastoparan's antibacterial and antitumor activities and reduce its cytotoxicity,the molecular modification was carried out by molecular hybridization,and the biological activity of the designed peptide was identified.A novel hybrid peptide KL-21 was obtained by using the N-terminal 1-8 sequences fragment of cecropin A and the conserved sequence of mastoparan.The physicochemical parameters and structures of KL-21 were analyzed by bioinformatics method.The antibacterial activity of KL-21 was studied with MP-L as reference.In addition,the hemolysis rate of the two peptides and the activity of anti-tumor cell A549 were measured.The results showed that KL-21 could quickly kill bacteria in a shorter time.The minimum inhibitory concentration (MIC) of KL-21 to Gram-positive bacteria (S.aureus) and Gram-negative bacteria (E.coli) was 4-8 μg/mL,and the minimum bactericidal concentration (MBC) was 8-16 μg/mL.The MIC and MBC of KL-21 to fungus (C.albicans) were 32 and 64 μg/mL,respectively.The hemolytic activity of KL-21 was only 20% at 128 μg/mL,which was lower than that of MP-L.KL-21 could inhibit lung cancer cell A549 with inhibition rate in vitro about 86% at 16 μg/mL.These results indicated that KL-21 had higher antibacterial and antitumor activity and lower cytotoxicity than MP-L,which could be used as a leading peptide for further research and development.     

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。     

家蝇抗菌肽的分离纯化及生物学活性

将诱导家蝇提取的家蝇抗菌肽提取物，经凝胶过滤层析和离子交换层析，得到具有抗菌活性的单一峰，质谱结果显示抗菌肽分离物含有4种小肽，相对分子质量678．3～1017．2。家蝇抗菌肽对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、巴氏杆菌）的抗菌活性优于革兰氏阳性菌（金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌），对耐药性巴氏杆菌有较强的抗菌活性，对大肠杆菌的MIC为4．2～8．4mg／L，对耐药性巴氏杆菌的MIC为3．8～7．8mg／L。扫描电镜观察发现，家蝇抗菌肽通过损伤细胞壁使细胞质外流而达到杀菌的目的。家蝇抗菌肽对家兔、鸡、猪、小鼠、番鸭、鹅和家鸭红细胞无溶血反应和凝集反应。‘     

潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达

为了实现以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽LL37,在pGAPZαA质粒的基础上,通过EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切将Zeocin抗性基因替换成潮霉素磷酸转移酶基因,获得的表达质粒命名为pGAPHαA。根据LL37氨基酸序列,通过毕赤酵母密码子偏嗜性改造,合成的LL37基因片段克隆到pGAPHαA质粒中,获得重组分泌型表达质粒pGAPHαA-LL37,线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168,经潮霉素B筛选阳性转化子。72 h表达上清LL37蛋白含量约为167 μg /mL,表达产物耐热性好,对大肠杆菌DH5α、猪链球菌最小抑菌浓度分别为2.94、7.06 μg/mL。     

载铜蒙脱石体外杀菌效果及其机理

选用断奶仔猪肠道中的大肠杆菌K88和猪霍乱沙门菌作为指示菌。杀菌性能的测定采用最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,并绘制杀菌曲线。原子吸收光谱仪测定Cu2＋在肉汤和生理盐水中的释放量;透射电镜观察细菌细胞壁的变化;全自动生化分析仪测定细菌胞内酶的活性;通过K＋电极测定K＋释放量;采用SP-2型溶氧仪测定菌体悬浮液中的溶氧量。结果显示,载铜蒙脱石对E.coli K88的MIC为64mg/L,MBC为256mg/mL;对S.choleraesuis的MIC为128mg/L,MBC为512mg/L。而蒙脱石未显抗菌活性。透射电镜下观察细菌与载铜蒙脱石作用后形态发生了变化,细菌细胞膜受损,内容物外漏;细菌胞内酶活性结果显示,胞内酶的大量外漏,与对照组相比,均差异极显著（P〈0.01）;大量自由的K＋从细菌细胞内释放出来;呼吸代谢结果显示,载铜蒙脱石抑制了细菌呼吸代谢的三羧酸循环途径。结果表明,载铜蒙脱石具有强大的杀菌作用。     

中草药对奶牛乳房炎致病菌的体外抑菌效果

选择常用6味中草药煎剂及中药复方制剂,采用试管二倍稀释法,对所分离的3种致病菌进行抑菌试验,并测定了最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）. 体外抑菌试验结果表明：鱼腥草对大肠杆菌有较强的抑菌活性,MIC为62.5 g/L.野菊花、连翘、金银花对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性,MIC分别为15.7、31.3和31.3 g/L.金银花、连翘对无乳链球菌有较强的抑菌活性,MIC为15.7和31.3 g/L.而复方中金银花＋野菊花＋连翘相对其它4个组方对3种致病菌都有较强的抑菌活性.     

Bacteriostatic Test in vitro of Traditional Chinese Medicine Radix Dichroa Powder on Common Pathogens

The purpose of this study was to indicate the antibacterial effect of traditional Chinese medicine Radix dichroa powder (RDP) in vitro. Minimal inhibitory concentration (MIC) of RDP for 12 pathogens were determined by two fold dilution method and agar dilution method, and the dose-effect relationship of antibiotic effect was studied, and the antimicrobial effect was also observed by Oxford-cup method. The results from two fold dilution method indicated that RDP had stronger inhibited effect to Streptococcus and Bacillus subtilis (MIC were from 15.6 to 62.5 mg/mL) than that of S. aureus (MIC was about 250 mg/mL), Enterobacteria (MIC was about 500 mg/mL) and fungi (MIC > 500 mg/mL); The results of agar dilution method showed that RDP had some antibacterial activities on Proteusbacillus vulgaris, Candida albicans And aspergillus niger, MIC was about 500 mg/mL, while it had weak antibacterial effect on other pathogens (MIC > 500 mg/mL). The results of Oxford-cup method showed that RDP (500 mg/mL) had some degree antimicrobial effect on pathogens, and the bacteria-inhibiting ring diameter of RDP not exceeded 10 mm, while drug-action ring was observed obviously around the Oxford-cup, and the number of bacteria was significantly decreased within the ring. In conclusion, RDP had some degree antibacterial effect on common pathogens, but the effects were not strong because of charicteristics of RDP itself and lower effective content.     

中药常山散的体外抑菌作用研究

试验旨在研究中药常山散的体外抑菌活性。分别采用试管二倍稀释法联合琼脂平板稀释法及营养琼脂稀释法对选用的12种致病菌进行抑菌试验,测定最低抑菌浓度（MIC）,进行抗菌作用量效关系研究,并通过牛津杯法观察药物抑菌效果。试管二倍稀释法联合琼脂平板法结果表明,常山散对链球菌属和芽孢杆菌的抑菌效果较强,MIC在15.6~62.5 mg/mL之间;对金黄色葡萄球菌和肠杆菌有较弱的抑菌作用,MIC在250~500 mg/mL之间;对真菌的抑菌作用最弱,MIC值 > 500 mg/mL,其抑菌强度大小依次为：链球菌属、芽孢杆菌、肠杆菌、真菌。营养琼脂稀释法结果表明,常山散对变形杆菌、白色念珠菌及黑曲霉具有一定的抑菌作用,MIC约为500 mg/mL,而对其他链球菌属、肠杆菌属及芽孢杆菌属细菌的抑菌效果较弱,MIC值均 > 500 mg/mL。牛津杯法抑菌活性研究结果显示,常山散药液（500 mg/mL）对12种菌均有一定的抑菌效果,但抑菌效果较弱,绝大多数抑菌环直径≤10 mm。牛津杯周围可见明显的药物作用圈,作用圈内细菌数量较其他部位明显减少。综合以上试验结果,中药常山散对常见致病菌均具有一定抑菌效果,但由于药物本身的特性及有效组分含量较低,其抑菌作用效果较弱。