鸭源H5N5和H5N1亚型禽流感病毒BALB/c鼠感染试验

比较鸭源H5N5亚型禽流感病毒(A/Duck/Changchun/01/2010)和鸭源H5N1亚型禽流感病毒(A/Duck/Liaoning/N/2011)对BALB/c鼠的致病性。以106EID50/50μL剂量鼻腔感染6周龄BALB/c鼠,攻毒后3,5,7,10,14 d取小鼠的肺、脑和肝脏,处理后接种10日龄SPF鸡胚做病毒回收试验,取死亡鸡胚的尿囊液进行RT-PCR检测;分别取接种病毒后5 d小鼠的脑、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏进行病理组织学检测。结果显示,小鼠接种H5N5和H5N1亚型禽流感病毒后,均无明显的临床症状,肝脏中分别于接种后3,5 d分离到病毒,肺脏中于接种后5 d分离到病毒,脾脏、肾脏和粪便中均未分离到病毒。病理组织学检测发现,病毒对小鼠的脏器组织产生了不同程度的病理损伤,以肺脏、脑和肝脏较为明显,且H5N1亚型禽流感病毒引起小鼠脑和肝脏的病理损伤比H5N5亚型更严重。这表明2株鸭源禽流感病毒对小鼠均有一定的致病性,且H5N1亚型强于H5N5亚型。     

2株H5N1亚型禽流感病毒人工感染鸭的组织病理学观察

鸭经肌肉接种禽流感病毒A/duck/Guangdong/185/2004（H5N1）和A/duck/Guangdong/221/2004（H5N1）后,2周内未见死亡,但具有一些显微和超微病理学变化,主要表现为呼吸道、消化道黏膜受损,心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脑等器官一定程度的充血、淤血、出血、水肿及实质细胞变性、坏死和炎症等。     

H9N2亚型禽流感病毒对樱桃谷肉鸭的致病性

为了研究H9N2亚型禽流感病毒（AIV）对樱桃谷肉鸭的致病性。本试验利用1株鸭源H9N2亚型AIV分别通过静脉注射和鼻内接种途径感染2周龄健康樱桃谷肉鸭,观察感染鸭的症状、排毒规律及组织学变化,流式细胞术分析外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞变化规律,实时荧光定量（RT-qPCR）检测脾脏中细胞因子的表达水平,并测定血清HI抗体效价。结果显示,攻毒后,静脉注射组鸭出现体质量增长显著缓慢、呼吸道症状以及全身性感染,而鼻内接种组鸭无明显临床症状,仅发生局部感染;两攻毒组鸭泄殖腔较气管排毒量高且排毒时间长;外周血CD8^＋T细胞显著升高,并且脾脏IFNA、IFNB、IFNG和IL2表达水平上调,IL1B和IL6表达水平仅在静脉注射组上调;血清HI抗体水平低且维持时间短。结果表明,在实验室条件下,H9N2亚型AIV对樱桃谷肉鸭致病力较弱,仅静脉接种组引起鸭体质量增长缓慢及呼吸系统出血、淋巴细胞浸润。     

鼻气管鸟杆菌对SPF雏鸡的致病性

通过气管、消化道和肌肉注射接种鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale,ORT）人工感染SPF雏鸡,观察试验鸡的发病情况及症状,并检测各试验组和对照组的体质量;利用建立的PCR检测方法对试验组和对照组的排菌情况进行动态观察;于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组鸡只,采集心脏、肝脏、肺脏和气管等组织固定、切片、H.E.染色,观察各器官病理组织学变化,利用建立的IFA方法对ORT在雏鸡体内的分布进行研究,并进行血常规和血液生化指标检测。结果表明,ORT接种后,主要引起雏鸡的呼吸困难、咳嗽等症状,增重明显降低;病理组织学变化以肝脏、心脏组织细胞变性,气管和肺脏广泛性出血和炎性细胞浸润为特征;IFA阳性信号主要分布于肺脏和气管;从感染后2～8d一直可持续排菌;HGB、WBC、RBC、BUN和AST发生显著变化。这表明ORT感染主要引起雏鸡的呼吸系统病变,气管接种比消化道和肌肉注射接种对雏鸡致病性强,肺脏和气管是ORT侵害的主要靶器官。     

不同禽流感疫苗和不同接种剂量免疫麻花鸡的免疫效力试验

对我国目前推广的5种不同禽流感疫苗进行了免疫效果的比对分析;对麻花鸡群以不同免疫剂量进行接种,比较分析了疫苗剂量对禽流感免疫效果的影响;对比结果表明,重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型,Re-1株）、禽流感灭活疫苗（H5N2亚型,N28株）、禽流感（H5＋H9）二价灭活疫苗（H5N1Re-1＋H9N2Re-2株）抗体水平高,效果稳定,这3种疫苗为乌鲁木齐市麻花鸡禽流感防控中的疫苗首选;不同免疫剂量的对比试验结果表明,最佳禽流感疫苗接种剂量为0.5ml。     

H9N2亚型禽流感病毒对豚鼠致病力的研究

为了研究用豚鼠建立禽流感动物模型的可能性,试验采用禽流感病毒Ck/HB/4/08(H9N2)鼻腔接种豚鼠,检测H9N2禽流感病毒对豚鼠的致病力。结果表明:感染后的豚鼠出现聚堆、精神不振、流鼻涕等感冒症状,体温及体重均发生显著变化,同时能够产生相应抗体;感染豚鼠的肺脏出现严重的淤血及水肿,肺泡形态发生改变并伴有大量炎性细胞浸润;鼻甲骨和肺脏中可检测并分离到病毒,其他组织器官未检测到病毒。感染豚鼠的临床症状及病理、体重、体温、抗体、肺干湿重的变化和组织中病毒的检测和分离结果说明H9N2亚型禽流感病毒可以感染豚鼠发病,症状明显,但不引起豚鼠死亡,可以建立禽流感感染豚鼠的发病模型。     

鸡源减蛋综合征病毒SD01株对种鸭致病性的研究

为研究鸡源减蛋综合征病毒(EDSV)对种鸭的致病性,本研究利用鸡源EDSV SD01株通过口腔途径人工感染实验种鸭,观察实验鸭产蛋量和病理组织学变化,采用血凝抑制试验和荧光定量PCR方法对实验鸭血清抗体滴度、组织器官中病毒载量及排毒规律进行检测。结果显示,实验鸭感染鸡源EDSV后有轻微的呼吸道症状,产蛋量下降,抗体滴度有明显升高趋势。病理组织学变化表现为肺脏、大脑、肾脏、脾脏、卵泡等器官出血以及淋巴细胞浸润,输卵管黏膜水肿、肝脏肿大,肝细胞脂肪变性。荧光定量PCR检测结果显示,不同组织病毒载量和感染持续时间不同,在实验期间,所检测的各组织中均有病毒存在;其中肝脏、输卵管中病毒载量明显高于其他组织器官,气管、肠道中病毒载量最低。以上结果表明鸡源EDSV SD01株对种鸭具有一定的致病性。     

新疆商品代AA肉鸡接种禽流感疫苗的免疫效力观察

分别应用禽流感灭活疫苗（H5亚型,N28株）、禽流感（H5N2＋H9N2）二价灭活疫苗（N28株＋SD696株）、禽流感（H5＋H9）二价灭活疫苗（H5N1Re-1＋H9N2Re-2株）和禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rL—H5株）4种禽流感疫苗,接种不同批次的商品代AA肉鸡,通过血凝抑制试验测定免疫后不同时期的抗体水平,确定各种疫苗对商品代从肉鸡的免疫效果。结果表明,在免疫20d后,禽流感（H5＋H9）二价灭活疫苗（H5N1Re－1＋H9N2Re－2株）刺激肉鸡群产生的HI抗体均高于禽流感灭活疫苗（H5亚型,N28株）、禽流感（H5N2＋H9N2）二价灭活疫苗（N28株＋SD696株）和禽流感－新城疫重组二联活疫苗（rL—H5）．差异显著（P〈0．05）。     

新议禽流感病毒

禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的高度接触性传染病,国际兽疫局（OIE）定为A类传染病。A型流感病毒具有宿主特异性,感染禽类并致病的通常是H5、H7和H9亚型。在我国H9N2亚型禽流感仍是当前禽流感流行的主型。接种疫苗是预防禽流感发生与传播的最有效手段,由于鸭等水禽的H9N2亚型AIV疫苗根本没有引起足够的重视,因此水禽是预防禽流感的最大隐患。     

H9N2亚型禽流感荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在家禽体内各个器官的分布,试验针对H9N2亚型AIV的HA基因设计1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin的引物,以阳性重组质粒作为标准品做标准曲线,建立荧光定量RT-PCR检测方法,并对人工感染H9N2的SPF雏鸡气管、胸腺、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠等器官进行3次重复检测。结果表明:该法线性关系R值均在0.99以上,检测极限均为10拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于1%。通过比较各器官HA相对表达量,得出肠和胰腺中HA相对表达量最高,腺胃次之,脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊中含量也比较高,气管、肺脏、肾脏中含量较低,其中肾脏含量最低。说明研究建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,特异性强。     

一例种鸭输卵管炎大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

对发病种鸭的肝脏、心脏、输卵管内容物进行分离培养、形态镜检和生化试验,在输卵管内容物中分离到1株大肠杆菌。经过药敏试验,结果显示分离菌株对头孢类和氨基糖苷类药物高度敏感,特别是对头孢曲松、庆大霉素高度敏感;对羧苄青霉素、阿莫西林、四环素、强力霉素、多黏菌素B、复方新诺明中度敏感;对喹诺酮类药物、利福平不敏感。     

禽流感H_5和H_9混合疫苗免疫肉鸽的效果试验

将禽流感H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-4＋Re-5）和H9亚型（SS株）灭活疫苗等量均匀混合,采用不同剂量不同次数分别注射。用血凝和血凝抑制试验方法检测H5亚型（Re-4、Re-5）和H9亚型（SS株）抗体效价。试验表明：以较小剂量0.5ml/只,间隔21d二免能产生整齐、持久、高滴度保护抗体,据此提出鸽H5和H9亚型禽流感多价混合疫苗的参考免疫程序。     

仙台病毒核蛋白的原核表达及鉴定

本研究从一株鼠仙台病毒（Sendai virus,SeV）中扩增获得核蛋白（nucleocapsid protein,NP）基因,将其克隆入pET32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。将原核表达产物作为免疫原,免疫BALB/C小鼠,制备获得抗NP的特异性多抗,经间接免疫荧光法和Western blot法检测,该表达产物原具有良好的免疫原性。将该产物纯化作为包被抗原,建立了一种检测SeV感染的间接ELISA方法。通过H1N1流感病毒、H9N2流感病毒、新城疫病毒阳性血清进行交叉试验表明：该间接ELISA方法有很好的特异性。这为实验动物仙台病毒抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

高、低产双黄蛋高邮鸭卵巢组织差异分析

本试验以高邮鸭为研究对象,选择双黄蛋高、低产组高邮鸭各6只,颈动脉放血致死后立即采集下丘脑、垂体、肝脏、输卵管及卵巢组织,将采集的卵巢组织通过组织切片、HE染色观察卵巢形态结构,并对双黄蛋高、低产组高邮鸭卵巢中等级卵泡进行统计对比;进行特异性标记蛋白卵泡刺激素受体（FSHR）免疫组化染色,观察两组高邮鸭卵巢阳性细胞表达情况及卵巢颗粒细胞分布;同时提取下丘脑、垂体、肝脏、输卵管及卵巢组织RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测FSHR基因的表达。结果显示,双黄蛋高产和低产组高邮鸭卵巢在组织结构及卵泡发育上存在明显差异,高产组卵巢上的卵泡繁密且发育良好,密布着众多小黄卵泡、大白卵泡及小白卵泡,各级卵泡大小差异明显;而低产组卵巢上的卵泡稀疏且发育较为迟缓,小黄卵泡、大白卵泡及小白卵泡数量较少。实时荧光定量PCR检测结果表明,高产组高邮鸭下丘脑、垂体、肝脏及输卵管中的FSHR基因表达量极显著高于低产组（P<0.01）,而卵巢中FSHR基因表达量在两组中差异不显著（P>0.05）。本试验结果表明,双黄蛋高、低产组高邮鸭的卵巢结构及卵泡发育存在显著差异,卵巢上的微环境可能是影响高邮鸭双黄蛋产蛋性能的影响因素。     

牛磺脱氧胆酸钠和CpGDNA对灭活H9N2禽流感病毒鼻腔免疫鸭的呼吸道抗体分泌细胞的影响

运用牛磺脱氧胆酸钠和CpG DNA配合鸭源禽流感H9N2灭活病毒滴鼻免疫雏鸭,通过检测鸭呼吸道各组织中IgA和IgG抗体分泌细胞面积的变化对免疫效果进行评价.结果发现:应用牛磺脱氧胆酸钠和CpG DNA配合H9N2灭活病毒鼻腔免疫后3、5和7周,鼻腔、气管和气管叉组织中的IgA和IgG分泌细胞面积显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)高于单独H9N2灭活病毒免疫后的水平;应用CpG DNA配合H9N2灭活病毒鼻腔免疫后鼻腔和气管组织中IgA和IgG分泌细胞的面积有部分提高(P＜0.05);而单独运用H9N2灭活病毒鼻腔免疫后IgA和IgG分泌细胞面积同对照组相比没有显著差异.结果表明:在牛磺脱氧胆酸钠和CpG DNA的配合下,禽流感H9N2灭活病毒鼻腔免疫能够提高雏鸭呼吸道组织中IgA分泌细胞和IgG分泌细胞的面积,有效地增强呼吸道局部的免疫应答水平.     

上海地区活禽批发市场H9亚型禽流感病毒调查

为弄清上海地区活禽批发市场中H9禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的流行情况及鸡群的免疫情况,2009年对上海三大活禽批发市场进行了采样监测。采用HI试验检测H9 AIV抗体、荧光RT-PCR试验和鸡胚接种分离鉴定病毒。共采集110批次1 646份血样和喉头泄殖腔棉拭样品,平均抗体合格率为60.27%,分离到H9病毒134株,其中4-6月和9-11月为全年中病毒分离的2个高峰期（样品带毒率均超过了10.00%）,明显比其它月份要高（其他月份均低于5.00%）,样品带毒率平均为8.14%。不同市场、不同地区采集的样品其抗体合格率和样品的带毒率也存在一定的差异。在30批分离到病毒的样品中,13批次已免疫H9N2油乳剂灭活苗且抗体合格率均大于70.00%的样品中分离到45株病毒（45/195）,其中6批次抗体合格率达到100%的样品中也分离到了病毒（8/90）,但带毒率明显比未经疫苗免疫的样品（79/255）低。调查结果表明养殖户对肉鸡群H9N2油乳剂灭活苗免疫重视程度不够,鸡群中带毒现象较普遍。疫苗免疫后能产生较高的免疫抗体,且抗体能减轻临床症状,降低带毒率,但不能完全阻止病毒复制,存在高抗体下带毒现象。     

间接免疫荧光方法快速检测番鸭呼肠孤病毒病

本研究应用具有免疫荧光特性的抗番鸭呼肠孤病毒病单克隆抗体(MDRV 237-11)建立了检测番鸭呼肠孤病毒病抗原的间接免疫荧光(Mab-IFA)方法。结果显示人工感染MDRVMW9710株病毒后发病和死亡番鸭组织切片均可检出阳性病灶;且组织匀浆经尿囊腔途径接种12日龄番鸭胚,取死亡胚心制作冰冻切片进行IFA鉴定呈阳性结果。表明该方法特异性好、可用于快速检测番鸭呼肠孤病毒病。     

2009—201O年新疆地区家禽禽流感免疫抗体监测与分析

2009—2010年,对新疆部分地区蛋鸡、肉鸡、家养水禽的养殖场随机采集血清样品10193份,活禽市场采集血清样品1620份。用HI方法对禽流感免疫抗体进行检测,结果表明:蛋鸡的H5免疫抗体合格率为33.33%～100%,其中0效价率为33.33%～80.00%;H9免疫抗体合格率为62.4%～100%,20%～33%蛋鸡场存在100%的0效价现象。肉鸡H5免疫抗体合格率为0%～100%,其中7.69%～69.6%肉鸡群中H5抗体0效价率为100%。水禽的H5免疫抗体合格率为0%～100%,有25%～33.33%鸭群全部是0效价。活禽市场H5抗体效价≧4log2的比例为10.59%～83.57%,H9抗体效价≧4log2的比例21.70%～67.14%。     

2009—201O年新疆地区家禽禽流感免疫抗体监测与分析

2009--2010年,对新疆部分地区蛋鸡、肉鸡、家养水禽的养殖场随机采集血清样品10193份,活禽市场采集血清样品1620份。用HI方法对禽流感免疫抗体进行检测,结果表明：蛋鸡的H5免疫抗体合格率为33．33％～100％,其中0效价率为33．33%-80．00％;H9免疫抗体合格率为62．4%-100％,20%-33％蛋鸡场存在100％的0效价现象。肉鸡H5免疫抗体合格率为0％-100％,其中7．69%-69．6％肉鸡群中H5抗体0效价率为100％。水禽的H5免疫抗体合格率为0%-100％,有25％33．33％鸭群全部是0效价。活禽市场H5抗体效价≥410g2的比例为10．59％-83．57％,H9抗体效价至410醇的比例21．70％-67．14％。