转基因小鼠的多重PCR快速检测技术

转基因检测技术的标准化可以为转基因法规的制定和转基因产品的标识提供技术支持.采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组DNA,用PCR方法检测其中的外源基因结构如cytomegalovirus(CMV)启动子、hGH polyA终止子及目的基因跨膜蛋白66(Transmembrane protein 66,Tmem66),筛选到阳性样品.优化了多重PCR引物退火温度及缓冲液浓度,并探讨了扩增速率对多重PCR的影响.结果表明,此多重PCR方法可得到很好的扩增效果,可用于转基因小鼠外源基因的检测,同时为哺乳动物检测标准的建立提供参考.     

转基因牛多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测转基因牛的多重PCR方法,针对牛线粒体16 S rRNA基因(BOS mtD-NA16 S rRNA,BOS)、转基因动物常用标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)、人乳铁蛋白编码基因(human laetoferrin gene,hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(human α-lactalb...     

转人血清白蛋白基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境监测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据转基因奶牛内源基因β2-微球蛋白基因(β2-microglobulin,B2 M),外源基因人血清白蛋白基因(Human α-lactalbumin,α-LA)及标记基因绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。该方法敏感、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

豆粕饲料中转基因成分的多重PCR快速检测

以大豆内源基因、35 S启动子基因、NOS终止子和35S-CTP4为检测对象,研究了对内源基因与外源基因的引物终浓度配比及退火温度对转基因豆粕多重PCR检测的影响.结果表明,建立的多重PCR方法能够准确的同时检测出豆粕中的内源基因和转基因成分.     

转人溶菌酶基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)设计奶牛内源性基因引物,根据外源基因人溶菌酶基因(human lysozyme,hLY)及标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法灵敏、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

多重PCR检测3种鸡球虫方法的建立

根据GenBank中发表的巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫TS-1序列,设计了3对引物,建立了这3种球虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了研究,对巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的混合卵囊进行了初步应用.结果显示:单一PCR和多重PCR均能扩增出巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫特异性条带,其大小分别为151 bp、463 bp、303 bp,其最小检测浓度为0.5ng,对水牛梭形肉孢子虫、有毒艾美耳球虫、猪源弓形虫汤山株及其田间分离株均不起反应,表明建立的方法具有很强的特异性和较高的敏感性,可望用于巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的诊断和田间种类调查.     

布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。     

3种分支杆菌多重PCR快速检测方法的建立

本试验旨在构建一种以不同分支杆菌特异片段为目的基因的多重PCR检测方法。采用GenBank公布的结核分支杆菌RD10序列、牛分支杆菌moaB3序列、鸟分支杆菌16-23SrDNA序列设计并合成特异性引物,扩增产物条带分别为954bp、297bp、119bp。结果显示,三段目的基因都有很高的特异性,对比菌株均无扩增产物出现。对倍比稀释的模板质粒进行检测,该方法的最低检出量为103 copies/μL的DNA模板,该方法特异、敏感、重复性好。首次应用的moaB3基因所得扩增效果良好,成功区分出牛分支杆菌。此多重PCR方法可用于结核分支杆菌、牛分支杆菌、鸟分支杆菌的鉴别和牛结核病的快速临床检测。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒（CaPV）末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性。与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性。表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

根据GenBank中20株猪圆环病毒（PCV2）核苷酸序列设计两对引物，建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法，其中引物P1、P2为PCV特异性，扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp，因此本方法不仅可以扩增PCV片段，还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性，为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。     

霍乱弧菌及肠出血性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

针对霍乱弧菌肠毒素和肠出血性大肠杆菌志贺毒素基因（ctx、stx1和stx2）设计引物,扩增大小不同的特异性片段,优化反应条件,建立多重PCR方法,对人工污染的水样品进行模拟检测。结果显示,多重PCR扩增系统针对目的菌具有高度的特异性。敏感性试验证实,当多重PCR反应体系中模板含量在10CFU时仍能检出。模拟水样品多重PCR检测的敏感性试验证明,人工污染的河水直接集菌检测敏感性为100～1 000CFU/mL,增菌培养后多重PCR检测敏感性可达1CFU/mL。本试验于同一PCR体系检测霍乱弧菌和肠出血性大肠杆菌的毒素基因,可用于这2种致腹泻性病原菌的快速检测。     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

产气荚膜梭菌多重PCR定型方法的建立及其应用

建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,只有产气荚膜梭菌呈现阳性,被检验的其他梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性;将肉汤菌液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×104CFU/mL。收集40份牛粪便样品,进行PCR检测,32份样品中成功扩增出589 bp的α毒素基因片段,阳性率为80%。结果显示,建立的多重PCR检测方法可取代血清中和试验,用于产气荚膜梭菌分型,同时表明A型产气荚膜梭菌在当地奶牛场中较为普遍。     

牛新孢子虫内标多重PCR检测方法的试验

本试验以牛新孢子虫NcSAG1基因、Nc-5基因和NcSRS2基因作为检测新孢子虫病的目的基因,以牛性腺(prolac-tin)基因作为内标对反应过程进行监测,对上述基因各设计1对引物。结果表明,4对引物可分别扩增出201bp、231bp、256bp和156bp的目的条带。经反应条件的优化,该方法具有较好的灵敏度,各质粒在103 copies/反应时,均可于同一管中扩增出较清晰的目的条带,只比单重PCR的灵敏度低了10倍,且不受内标模板存在的影响。经临床应用研究,该方法具有较好的特异性和重复性,可用来对新孢子虫进行快速准确的检测。     

仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

本研究以致泻性大肠杆菌(DEC)的4种毒力因子EAST1、LT、STa和STb为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,以建立仔猪DEC的多重PCR检测方法.该方法具有较好的特异性,只对DEC产生特异性条带,对非DEC及其他病菌则呈阴性.利用所建立的多重PCR方法对吉林省各猪场采集的样本进行检测,结果表明,在测定的猪场中...     

鸡胚胎性病原茵多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏茵(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.aviun的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化.结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的茵发生反应.经优化B.aviun、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL.本研究建立的多重PCR方法为相关病原茵的快速检测提供方法.