低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒。感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降。低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒。利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,己获得了一些很有意义的发现。本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制。低毒病毒／板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统。     

低毒病毒-板栗疫病菌系统作为抗正链RNA病毒化合物筛选模型的研究

板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）是引起板栗疫病的病原真菌。低毒病毒是一类侵染板栗疫病菌的无衣壳正链RNA病毒。无病毒栗疫病菌野生型菌株在PDA培养基上形成桔黄色菌落,而带毒株在则形成白色菌落。本研究利用已知的不同机制的抗病毒药物处理无病毒和感染病毒的板栗疫病菌菌株,观察菌丝体颜色变化并检测菌丝体中病毒双链RNA（dsRNA）的含量。结果显示,抗病毒药物处理后,带毒株系EP721和Euro7的菌丝体颜色表型发生明显变化,且病毒dsRNA累积量与菌丝体颜色变化存在明显相关性：随着药物浓度增大,菌丝体颜色加深,病毒dsRNA积累量下降。因此,可以根据菌株颜色的变化判断药物对病毒复制或症状表现是否有效,从而极大简化抗RNA病毒药物的初步筛选过程。     

在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29

p29蛋白是低毒病毒基因组编码的一个木瓜蛋白酶样蛋白。前人研究发现,在宿主板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）体内表达p29,会引起真菌毒力降低,色素产生减少,丧失产生无性孢子的能力。除已知p29与源于高尔基体的膜结构共分离之外,p29在细胞内的其它分布形式未明。本研究在成功制备p29特异抗体和高效分离板栗疫病菌线粒体的基础上,尝试用p29抗体检测线粒体中是否存在p29蛋白。Western印迹结果表明,受CHV1-EP713感染的EP713菌株线粒体中存在与p29抗体特异作用的病毒蛋白。本研究结果暗示,低毒病毒蛋白p29可能参与调控宿主线粒体功能。     

板栗疫病菌低毒力遗传转化株LC的构建

低毒病毒—板栗疫病菌组合是研究病毒—宿主相互作用的模式系统之一。通过构建含板栗疫病菌低毒病毒CHV1-EP713的全长cDNA和苯菌灵抗性基因的表达质粒pXB3F2,并用于转化野生型无毒株EP155,获得了以苯菌灵抗性为筛选标记、具有dsRNA病毒再生能力的低毒力遗传转化株LC,为深入研究病毒—真核宿主相互作用的分子机制提供了新的研究材料。     

应用二维液相色谱评价低毒病毒感染对板栗疫病菌总蛋白表达的影响

根据丝状真菌自身的特点,本文建立了一套完整的适合于板栗疫病菌蛋白质组分析的总蛋白质提取方法,并使用二维液相系统对野生强毒株EP155和受低毒病毒感染的弱毒株EP713进行了差异蛋白质组的比较。用ProteoVue和DeltaVue软件进行分析,得到了重复性较好的二维模拟凝胶图谱,在EP155和EP713之间共找到296个峰值差异强度在2倍以上的蛋白质紫外吸收峰：以EP155为标准,病毒感染导致蛋白上调的209个,下调的87个。根据蛋白质分子量,使用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到纯度更高的蛋白质条带,本研究为大规模质谱鉴定丝状真菌差异表达蛋白质提供了一种新方法。     

欧李叶片全长cDNA文库的构建和部分克隆的序列分析

采用SMART技术,构建了欧李(Prunus humilis Bunge)品系T8-1叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达6.17×10~7 pfu/mL,库容达3.7×10~7,重组率达95%,平均插入片段大小约为1.2 kb.随机挑取400个单克隆进行5'端测序,共获得364个欧李ESTs.绝大部分ESTs的长度在500～1300 bp之间,平均长度为877 bp,其中具有完整ORF结构的序列有221条,占60.71%.通过与NCBI等非冗余核酸数据库和蛋白质数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因181个(339个ESTs),相似性较低的未鉴定基因5个(9个ESTs),新基因14个(16个ESTs).     

紫茎泽兰cDNA文库的构建及RuBP羧化酶基因的筛选

采用SMART技术首次构建了高质量的紫茎泽兰cDNA文库。经过涂平板测定和酶切反应鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×107 cfu/mL,重组率达98 %,插入片段平均大小在900 bp左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了1×1012,覆盖率达99 %以上。利用该文库筛选得到了紫茎泽兰核酮糖二磷酸羧化酶(RuBP羧化酶)cDNA片段。     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒／板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统。本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的crypari凡基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体。构建的载体能成功表达GFP蛋白。利用该载体表达积累量较高的CHV1-Eur07病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10％提高至67％和80％。高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具。     

板栗疫病在广西区内的危险性分析

通过定性因素和定量指标体系相结合的方法对板栗疫病在广西的危险性进行评估,评估结果表明,此病害的危险性综合评价值为1.7128,属于中度危险性的林业有害生物。板栗疫病菌寄主范围广,此病在广西的分布已经相当广泛,但板栗疫病的病原菌不必补充为广西壮族自治区林业检疫性有害生物。通过采取栽培无病苗木、减少枝条和主干的伤口、削除枝条和主干的病斑和进行伤口的消毒、砍除重病枝等措施,可以有效地防治病害的发生。     

EST序列测定时 cDNA文库的构建和参数评估*

表达序列标签(EST)是一种快速有效揭示基因组容量的方法。综述了EST测定时cDNA文库的类型、载体的选择、文库质量的鉴定及处理方法。     

同源片段大小对板栗疫病菌同源重组频率的影响

低毒病毒／板栗疫病菌系统是一个具有独特优点的、崭新的研究病毒与宿主相互作用的模型系统。以同源重组为基础的基因打靶是研究基因功能和病毒与宿主相互作用分子机制的重要手段。为了研究在板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小对同源重组频率的影响，利用一段5．4kb板栗疫病菌染色体DNA序列，构建了以潮霉素抗性基因为遗传转化筛选标记的3个同源双交换片段以及3个同源单交换质粒，分别转化板栗疫病菌EPl55原生质体，检测筛选同源重组转化子并计算发生同源重组频率。结果表明，在板栗疫病菌中3个同源双交换片段FHA1（1．7～2.0kb）、FHA2（1.0～1.2kb）和FHA3（0.5kb）的同源重组频率分别为3．73％、2。06％和0；3个同源单交换质粒pFHl（1．76kb）、pFH2（1．23kb）和pFH3（O．54kb）的同源重组频率分别为0.95％、0和0。这些结果为板栗疫病菌同源重组遗传操作中同源片段大小的设计提供了依据。     

镉诱导的蚯蚓全长cDNA文库的构建与初步鉴定

采用人工土壤法，研究重金属镉(Cd2+)对成熟赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的急性毒性,表明蚯蚓对镉具有较强的耐受性。Trizol法提取蚯蚓RNA后，采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒，成功构建了低剂量Cd2+（200 mg•kg-1）诱导的蚯蚓cDNA文库，其库容量为3.02×105 pfu/mL,扩增后滴度为8.67×109 pfu/mL，重组率为97.3％, 绝大多数的cDNA插入片段≥0•5 kb,平均长度≈1•0 kb。所够建的cDNA质粒文库容量及插入片段大小符合合格文库要求, 为进一步筛选蚯蚓体内解毒、免疫相关基因，寻找生物标志物奠定了基础。     

大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库的构建及序列分析

为从基因差异表达的角度研究杂种优势的分子机理,构建了差减效率均为210倍的大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库。在大梅(被消减)-梅山库中挑选了610个有效克隆,经斑点杂交筛选出48个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了37个基因,其中28个EST是已报道基因的cDNA片段,9个在NCBI数据库中没有同源序列。在梅山(被消减)-大梅挑选了580个有效克隆,经斑点杂交筛选出45个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了34个基因,其中26个EST是已报道基因的cDNA片段,8个在NCBI数据库中没有同源序列。     

Grazing of a common species of soil protozoa (Acanthamoeba castellanii) affects rhizosphere bacterial community composition and root architecture of rice (Oryza sativa L.)

We performed a controlled experiment with rice seedlings (Oryza sativa L.) growing in Petri dishes on homogeneous nutrient agar containing a simple rhizosphere food web consisting of a diverse bacterial community and a common soil protozoa, Acanthamoeba castellanii, as bacterial grazer. Presence of amoebae increased bacterial activity and significantly changed the community composition and spatial distribution of bacteria in the rhizosphere. In particular, Betaproteobacteria did benefit from protozoan grazing. We hypothesize that the changes in bacterial community composition affected the root architecture of rice plants. These effects on root architecture affect a fundamental aspect of plant productivity. Root systems in presence of protozoa were characterized by high numbers of elongated (L-type) laterals, those laterals that are a prerequisite for the construction of branched root systems. This was in sharp contrast to root system development in absence of protozoa, where high numbers of lateral root primordia and short (S-type) laterals occurred which did not grow out of the rhizosphere region of the axile root. As a consequence of nutrient release from grazed bacteria and changes in root architecture, the nitrogen content of rice shoots increased by 45% in presence of protozoa. Our study illustrates that interactions over three trophic levels, i.e. between plants, bacteria and protozoa significantly modify root architecture and nutrient uptake by plants.     

小麦-大麦大穗大粒渐渗系WB13的分子细胞学鉴定

小麦新种质WB13是普通小麦(Triticum aestivum L.)品种7182与农家二棱大麦(Hordeum vulgare ssp.distichon Hsü.)杂交后回交多代衍生而来的大穗大粒材料。为了明确WB13的遗传基础,本研究利用形态学、细胞学、分子标记及特异片段回收测序等技术对其进行了鉴定。结果表明,采用小麦不同同源群简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对WB13和小麦7182进行遗传背景分析发现,两者遗传相似系数(genetic similarity coefficient,GS)达97.0%,田间表现为大穗、大粒,综合农艺性状较好;根尖细胞染色体数目为2n=42,以大麦基因组DNA为探针进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)未出现杂交信号;利用大麦特异序列标签位点(sequence-tagged site,STS)标记对WB13和农家二棱大麦进行扩增,发现ABG054(4H)和ABC305B(7H)两个标记在WB13中扩增出了大麦特征条带(分别记为WS1和WS3),经测序及序列比对,发现其与扩增到的大麦序列分别具有100%和98%的相似性,与EMBL数据库中的序列比对,与两者有相似性的全为大麦的序列。利用大麦4H和7H染色体上的35对SSR引物对WB13及其亲本进行扩增,发现与千粒重相关的标记MGB396(4H)在WB13中扩增出了大麦的特异条带。综合以上结果确定WB13含有大麦4H和7H染色体的遗传物质,为小麦-大麦渐渗系材料,且4H染色体渗入片段中可能携带与千粒重相关的有益基因。本研究确定了WB13为小麦-大麦杂种后代,此材料的育成丰富了小麦-大麦中间材料和大穗大粒材料的种质资源。同时本研究在分子水平上初步揭示了WB13大穗大粒特性的成因,为后续构建遗传分析群体进行相关数量性状(quantitative trait loci,QTL)定位及推动WB13的研究利用积累了基础资料。