基因外显子2的克隆与序列分析

 本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

骨形态发生蛋白15基因的研究进展

作者主要介绍了骨形态发生蛋白15的结构、功能与调控;骨形态发生蛋白15基因的结构、染色体定位,并讨论了该基因与哺乳动物繁殖性能的关系。     

济宁青山羊BMP15基因外显子2的克隆与序列分析

本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

山羊促性腺激素释放激素1基因外显子克隆及序列分析

促性腺激素释放激素1(gonadotropin-releasing hormone 1,GnRH1)是GnRH存在于脑下垂体的主要形式,它在调节生殖内分泌系统产生促性腺激素方面起着主要作用。根据牛GnRH1基因全序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测GnRH1基因外显子2、3和4在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊）、中等繁殖力山羊品种（波尔山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊和安哥拉山羊）中的单核苷酸多态性,分析该基因对山羊高繁殖力的影响;并对山羊GnRH1基因3个外显子进行克隆测序,推导出编码的氨基酸序列,然后将山羊核苷酸和氨基酸序列与牛、人、狗、黑猩猩、猴、大鼠和小鼠7个物种的序列进行同源性比较。结果表明,在4个山羊品种中均未检测到GnRH1基因3个外显子的多态性;8个物种的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为73.6%～99.3%和62.0%～97.8%。可见,哺乳动物GnRH1基因外显子2、3和4序列保守性较强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

骨形态发生蛋白BMPl5基因的研究进展

骨形态发生蛋白属于转化生长因子——β超家族,迄今为止,已有30多个骨形态发生蛋白被确定。BMP15基因是卵母细胞表达的一种分泌型信号分子,具有推动卵泡生长,阻止黄体早熟的作用。笔者对BMP15基因的结构和功能、BMP15基因多态性和基因定位、BMP受体种类及BMP受体信号转导机制作简要阐述。     

骨形态发生蛋白BMP15基因的研究进展

骨形态发生蛋白属于转化生长因子——β超家族，迄今为止，已有30多个骨形态发生蛋白被确定。BMP15基因是卵母细胞表达的一种分泌型信号分子，具有推动卵泡生长，阻止黄体早熟的作用。笔者对BMP15基因的结构和功能、BMP15基因多态性和基因定位、BMP受体种类及BMP受体信号转导机制作简要阐述。     

山羊高繁殖力候选基因骨形态发生蛋白受体I B的多态性分析

BMPR-IB基因中的A746G突变与Booroola绵羊高繁殖力完全相关.为了研究该基因与山羊繁殖力的关系,试验采用PCR-SSCP方法对河北中部本地山羊中不同繁殖力群体的BMPR-IB基因进行多态性检测.并通过BLAST、BioEdit、DNasp等生物软件对山羊、绵羊、人等6个物种BMPR-IB基因的CDS序列进行了生物信息分析.结果发现在供试山羊不同繁殖力群体BMPR-IB基因不存在A746G的突变,生物信息学分析发现35条序列闻存在370个多态位点,山羊和绵羊间的核苷酸歧义度和遗传距离是各物种间最小的.     

4个山羊品种BMP6基因部分片段的多态性分析

根据GenBank发表的绵羊骨形态发生蛋白6（bone morphogenetic protein 6,BMP6）基因部分序列所包含的外显子5、6、7和小鼠BMP6基因外显子5、6、7序列设计3对引物,采用PCR SSCP技术检测BMP6基因外显子5、6和7在济宁青山羊、安哥拉山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊4个山羊品种250个个体中的单核苷酸多态性。结果发现这3对引物的扩增片段在检测的4个品种中均无多态性,说明所检测的BMP6基因外显子5、6、7序列比较保守。     

山羊BMP15基因FecX-L突变的检测

采用PCR-SSCP方法在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊、波尔山羊和文登奶山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊、安哥拉山羊和辽宁绒山羊）中检测骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因的FecX-L突变,同时研究该基因突变对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明这6个山羊品种都没有发生与Lacaune绵羊相同的FecX-L突变（C53Y）。可见BMP15基因中影响Lacaune 绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。     

5个绵羊品种BMP6基因部分片段的多态及序列分析

根据GenBank发表的绵羊骨形态发生蛋白6（Bone morphogenetic protein6,BMP6）基因部分序列所包含的外显子5、6、7和小鼠BMP6基因外显子5、6、7序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMP6基因外显子5、6和7在小尾寒羊、湖羊、多赛特、特克塞尔、考力代5个绵羊品种301个个体中的单核苷酸多态性。结果发现这3对引物的扩增片段在检测的5个品种中均无多态性,说明所检测的BMP6外显子5、6、7序列比较保守。同时克隆了小尾寒羊（695bp）和济宁青山羊（699bp）部分BMP6mRNA以及小尾寒羊BMP6基因外显子3—4的内含子序列和两端部分外显子序列（785bp）。发现小尾寒羊和济宁青山羊的核苷酸和氨基酸序列差异很小,两者的核苷酸序列同源性高达99．28％,氨基酸序列同源性为98．1％,除济宁青山羊中插入一个丙氨酸外,两者只有4个氨基酸的差异。绵羊与牛、人、小鼠和大鼠的核苷酸同源性分别为97．04％、81．82％、84．68％和85．06％;氨基酸序列同源性分别为99．05％、91．43％、90．48％和92．38％,均大于90％,表明各物种BMP6核苷酸序列虽然差异较大,但氨基酸序列却非常保守。     

山羊生长激素基因部分序列的PCR-SSCP分析

以鲁北白山羊、波尔山羊和波尔山羊与鲁北白山羊的杂交一代、回交一代共计 2 74个个体为研究材料 ,对山羊生长激素基因 5′调控区 - 4 0 6～ - 1 93片段进行PCR扩增 ,扩增产物经SSCP分析发现存在多态性。结果表明发现波尔山羊及杂交后代以AA型占多数 ,而鲁北白山羊则BB型个体较多 ,基因型频率在品种间存在显著差异 (P <0 .0 5 )。对该片段的两种纯合型克隆测序发现 :AA型在第 6 0位发生了C→T的突变 ,第 2 1 1位发生碱基C的丢失     

山羊ESR基因外显子4的克隆和多态性分析

采用PCR-SSCP技术检测雌激素受体(ESR)基因外显子4在黄淮山羊和波尔山羊中的多态性,并对其单核苷酸序列进行克隆测序分析.结果表明:ESR基因外显子4在两品种山羊中均不存在多态性;克隆获得的山羊ESR基因外显子4的片段长度为232 bp,两品种山羊间的同源性98%,提示其在山羊中具保守性.     

济宁青山羊多羔性候选基因BMP15的研究

根据绵羊骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因序列设计2对引物（P1和P2）,分别扩增随机选取的安哥拉山羊和济宁青山羊各5个个体的BMP15基因外显子1、2并克隆测序。测序结果与绵羊BMP15基因外显子1（AF236078）相比,山羊BMP15基因外显子1在第268-270位插入3个核苷酸CTT（268insCTT）,导致编码的氨基酸第12位插入亮氨酸（12insL）;山羊BMP15基因外显子2序列长度与绵羊（AF236079）一致,但存在7处核苷酸不同,引起4个氨基酸变化,济宁青山羊与安哥拉山羊相比在963位存在核苷酸变化（A963G）。依据A963G变异设计引物P3,利用PCR-SSCP方法检测BMP15基因外显子2在高繁殖力品种（济宁青山羊）、中等繁殖力品种（波尔山羊）和低繁殖力品种（安哥拉山羊和内蒙古绒山羊）中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊多羔性的影响。结果在济宁青山羊中检测到AA、AG和GG基因型,在波尔山羊中检测到AG和GG基因型,在安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中仅检测到AA基因型;测序分析发现GG与AA基因型相比存在1个突变（A963G）,导致第300位的丝氨酸变为甘氨酸（S300G）;济宁青山羊AA、AG和GG基因型频率分别为0.008、0.059和0.933;高繁殖力山羊品种与中、低繁殖力山羊品种之间BMP15基因型分布存在显著（P〈0.05）和极显著（P〈0.001）差异;GG基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AG和AA基因型的分别多0.71只（P〈0.05）和1.57只（P〈0.05）,AG基因型比AA基因型的多0.86只（P〈0.05）。本研究结果初步显示BMP15基因可能是影响济宁青山羊多羔性的一个主效基因或是与之紧密连锁的一个标记。     

山羊催乳素基因PCR-SSCP分析

设计5对引物，采用PCR SSCP技术检测催乳素（prolactin，PRL）基因外显子1~外显子5在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊、波尔山羊、文登奶山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。通过克隆测序首次获得了山羊PRL基因外显子全序列。结果表明PRL基因在研究的4个山羊品种中都不存在单核苷酸多态性，提示检测的PRL基因座位对济宁青山羊高繁殖力没有显著影响。     

绵羊高繁殖力候选基因BMPR-IA的研究

以骨形态发生蛋白受体IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPR-IA）基因为候选基因，采用PCR—SSCP技术检测该基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、特克塞尔羊、德国肉用美利奴羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：在小尾寒羊中检测到AA、AB两种基因型，在湖羊中只检测到一种基因型BB，而在低繁殖力的3个绵羊品种中只检测到一种基因型AA。统计结果表明：小尾寒羊A等位基因频率为0．964，B等位基因频率为0．036。测序结果表明：BB型与AA型相比有6处核苷酸发生了突变。独立性检验表明：外尾寒羊与低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异不显著（P〉0．05），而湖羊与小尾寒羊、低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异极显著（P〈0．001）。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0．15只，但差异不显著（P〉0．05）。研究表明：BMPR-IA基因不是小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因。     

绵羊BMP15基因外显子单核苷酸多态性研究

以控制Belclare和 Cambridge绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15( Bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测BMP15基因在中国部分绵羊品种 (蒙古羊、内蒙古细毛羊、呼伦贝尔羊、中国美利奴羊)中的单核苷酸多态性,同时研究突变位点对绵羊繁殖力的影响.结果表明:在4个绵羊品种中均检测到BMP15的突变,检测到的BMP15突变在4个绵羊品种中均呈现3种基因型.这表明BMP15基因外显子Ⅰ中虽然存在突变位点,但这一突变位点对绵羊繁殖力高低没有显著影响.     

7个牛品种PON2基因第9外显子SSCP分析及其外显子多态性扫描

对氧磷酶2（Paraoxonase-2,PON2）产物是脂肪代谢过程中的抗氧化酶,被确定为影响相关重大心血管疾病和人类寿命的重要候选基因。本研究利用直接测序法对PON2基因所有外显子进行多态位点扫描,利用PCR-SSCP技术对中国西门塔尔牛、鲁西牛、秦川牛、晋南牛、荷斯坦牛、摩拉水牛和尼里-拉菲水牛7个品种的478头个体PON2基因第9外显子T98C位点进行多态性分析。结果表明,PON2基因外显子上共发现4个单核苷酸突变位点,但均未引起氨基酸的改变;第9外显子扩增大小为167bp的片段存在单链构象多态性。除鲁西牛和荷斯坦牛外,其它5个品种牛在该基因座位都处于Hardy—Weinberg平衡状态（P〉0．05）。鲁西牛、南阳牛、晋南牛和荷斯坦牛4个群体处于中度多态（0．25〈PIC〈0．50）,其它3个牛种为低度多态。除摩拉水牛和尼里-拉菲水牛不存在AA基因型外,其它5个牛品种中均存在AA、AB、BB3种基因型,但优势等位基因在7个品种牛群体中存在差异,基因型频率在鲁西牛和南阳牛中AA〉AB〉BB;晋南牛则3种基因型频率之比约为1：1：1;中国西门塔尔牛则出现严重的偏态,B等位基因为绝对优势等位基因;2种水牛中,BB基因型为优势基因型,B等位基因为优势等位基因。利用SAS9．1软件GLM过程分析基因型均值,用邓肯法（Duncan’s）进行基因型间的多重比较,将该基因座不同基因型与7个牛品种间和鲁西牛6个年龄组（n=238）进行了差异分析,结果表明,不同基因型在品种间存在极显著的差异（P〈0．01）;鲁西牛各年龄组与各基因型间差异不显著（P〉0．05）,但各种基因型间存在有着极显著的差异（P〈0．01）。结合各种基因型个体在不同年龄组间的变化趋势,AA型个体可能具有相对较长的使用寿命。     

山羊Ets-1基因cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种Ets-1基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,采用RT-PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Ets-1基因的cDNA序列。该序列全长2 263 bp(GenBank登录号HQ589338),包括5’UTR 331 bp,CDS 1 326bp和3’UTR 606 bp,编码441个氨基酸组成的蛋白质。核苷酸序列分析发现,山羊编码序列与牛、猪、人、小鼠等的相应序列同源性分别为98%、94%、92%和90%,3’UTR相应序列为96%、83%、81%和77%,5’UTR相应序列为98%、85%、82%和71%。氨基酸序列分析发现,山羊与牛、猪、人和小鼠的Ets-1的相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析发现,其蛋白质分子量为50 340.8 D,等电点为5.08,具有典型的螺旋-转角-螺旋结构域,不存在跨膜结构,并且整个序列不含信号肽。