病程相关蛋白质在水稻与白叶枯病菌互作过程中的表达

【目的】了解病程相关(pathogenesis-related,PR)蛋白质在植物防卫体系中的表达模式进而探讨水稻抗病的分子机理。【方法】选取10个前期工作中鉴定的差异转录PR基因,利用免疫印迹(Western blotting,WB)技术检测它们在水稻正常生长和与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo)互作过程中的表达丰度变化。【结果】发现随着水稻的生长,Os12g43380、Os12g36830、Os12g36860、Os12g36840、Os02g41670、Os05g35290和Os12g33610的表达逐步增加,一般在开花期达到最高,成熟期有所降低。在白叶枯病抗性基因Xa21介导的水稻-Xoo非亲和互作过程中,检测到Os01g51570、Os01g71680和Os12g36850的表达量上调,Os12g36830、Os12g36840、Os02g41670和Os05g35290的表达量下调,并且发现,在亲和互作和非亲和互作反应中PR蛋白质的变化模式相似。对PR基因上游启动子区进行分析,发现存在与抗病相关的顺式作用元件,其中,ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats等元件在抗病相关的PR基因上游出现频率较高。【结论】鉴定了在水稻-Xoo互作过程中发生丰度变化的7个PR蛋白质。     

不同光照条件对龙眼胚性悬浮细胞培养及柯里拉京合成的影响

【目的】研究不同光照条件对龙眼胚性悬浮细胞培养及柯里拉京代谢合成的影响,以期为龙眼胚性悬浮细胞大规模培养、工业化生产柯里拉京奠定理论基础。【方法】基于龙眼胚性悬浮细胞体系的建立,采用5 L新型搅拌式生物反应器放大培养龙眼胚性悬浮细胞,探讨黑暗和光照处理对龙眼胚性悬浮细胞生长、柯里拉京含量、蔗糖消耗以及培养体系中pH和DO(溶氧)的动态变化规律。【结果】龙眼胚性悬浮细胞在黑暗和光照条件下其生长动态大致均呈"S"形曲线,最大增重分别为4.74 g·L~(-1)和3.71 g·L~(-1);黑暗培养到第7 d龙眼胚性悬浮细胞体内柯里拉京含量达到最大值8.72 mg·g~(-1),是光照条件下的2.8倍,但在细胞培养液中柯里拉京含量明显低于光照条件(P0.05)。光照加快了龙眼胚性悬浮细胞对蔗糖的消耗速度,但对培养体系中的pH和DO无明显影响。【结论】生物反应器大规模培养过程中,黑暗条件利于龙眼胚性悬浮细胞生长及细胞内柯里拉京含量的积累,蔗糖消耗、pH和DO是龙眼胚性悬浮细胞生长及柯里拉京合成的重要调控因子。     

HCV p7下调基因p7TP2启动子序列的克隆及转录活性检测

【目的】克隆p7TP2基因的启动子区域,并检测HCV p7TP2启动子的转录活性。【方法】通过分析确定p7TP2基因翻译起始密码子ATG上游1 203 bp至下游147 bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆启动子片段并构建载体pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p,转染HepG2细胞,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测启动子活性。【结果】克隆了预测具有启动子活性的片段,成功构建了pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p载体,转染pCAT3-p7TP2-p的HepG2细胞,CAT表达活性是转染pCAT3-Basic细胞的5.98倍;转染pGLB-p7TP2-p的HepG2细胞,双荧光素酶表达活性是转染pGLB细胞的9.67倍。【结论】克隆的p7TP2启动子序列与预测的序列一致,并且具有启动子转录活性。     

PiggyBac转座子介导的诱导细胞永生化转基因载体的构建及其整合效率的检测

【目的】构建在小鼠水平上实现多个目的基因的表达以及标记基因安全删除的转基因载体。【方法】以载体为模板,分别扩增SV40P neo、IRES、tk-PloyA,通过overlap PCR连接,并在两端添加方向相同的LoxP序列,构建转基因基本载体PB-NIT;然后通过overlap PCR扩增获得Tet-CMV-SV40 T-T2A-p 53-PolyA基因表达盒,将其插入PB-NIT中,构建载体PB-NIT-STP;最后将转录因子激活域 rtTA 通过同尾酶连接插入PB-NIT-STP,构建载体PB-rtTA-NIT-STP。【结果】经酶切和测序等鉴定,以上载体均正确;经转座活性鉴定,共转染转座子载体PB-rtTA-NIT-STP和转座酶载体比只转染转座子载体获得的阳性克隆数提高了20倍。【结论】得到了基于PiggyBac转座子的可用于正负向筛选和诱导目的基因表达的转基因载体。     

小麦条锈菌转录因子PsSte12的克隆及生物学分析

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。     

盐胁迫下棉花LTR-反转座子的转录激活及在耐盐相关基因发掘中的应用

LTR-反转座子是棉花基因组的主要组成部分,在基因组中通常呈现"静止"状态。但受到胁迫刺激时,部分反转座子的转录活性可被"激活",可能影响邻近基因的表达。本研究在盐胁迫下通过生物信息学手段,在旱地棉转录组数据库中检测到3 885个转录激活的候选LTR-反转座子;这些候选LTR-反转座子上下游5 kb内共有1 787个邻近基因,其中377个邻近基因在盐胁迫下差异表达,通过对377个基因进行功能注释发现,326个基因注释到GO数据库中,并且部分基因与棉花已报道过的耐盐抗旱基因同源。本研究结果将为棉花的耐盐分子机理解析提供一定的理论基础。     

2个水稻器官特异表达基因的鉴定及分析

研究组织特异表达基因对揭示植物生长发育机制具有重要的意义。通过生物信息学、RT-PCR及荧光定量PCR方法鉴定了2个水稻特异表达基因,即Os01g18840叶特异和Os01g28500茎叶颖特异表达基因。通过检测它们在PEG、NaCl、ABA及暗处理下的表达情况,发现在各种胁迫处理下,Os01g18840基因的表达受到抑制,Os01g28500基因的表达受到诱导。进一步分析它们的基因及蛋白结构特点,发现Os01g18840蛋白含有1个卷曲螺旋结构域,是1个中间纤维蛋白;Os01g28500蛋白含有1个SCP类似结构域,是与病原反应相关的蛋白。另外,对它们上游启动子区的顺式元件进行分析,结果表明它们都含有大量的与叶片、叶肉细胞或绿色组织中表达相关的顺式作用元件。     

基因芯片分析芜菁雌蕊退化突变体tpa及野生型开放花的转录组差异

 【目的】基于转录组水平分析芜菁雌蕊退化突变(turnip pistil aborted, tpa)发生的可能原因,为揭示芸薹属作物雌蕊发育的分子遗传调控机制提供研究依据。【方法】 利用tpa及其野生型植株的开放花制备的mRNA反转录成cDNA与拟南芥ATH1芯片进行杂交,筛选出在tpa及其野生型植株中表达有差异的基因,并利用RT-PCR技术对芯片筛选出的基因进行验证。【结果】获得了152个在野生型(W1)和完全退化株(M3)转录组中差异表达的基因,61个在W1和部分退化株(I2)转录组中差异表达的基因,以及24个在I2和M3转录组中差异表达的基因,上述差异基因分别属于细胞壁合成与调控、防卫与胁迫反应、转录调控、蛋白质代谢以及普通新陈代谢等9个不同的功能类别。通过对41个基因的RT-PCR验证,获得了At2g42840、At1g57750、At5g20630、At2g03090、At3g08030、At5g08000、At2g28790、At5g63310和At2g24270等9个在tpa及野生型植株中具显著不同的时空表达特性的基因。【结论】 拟南芥cDNA 芯片可用于分析tpa及其野生型基因的转录差异,筛选获得的9个显著差异基因不但在雌蕊发育等生殖发育过程起重要作用,还参与了植物营养生长的生理生化过程。     

水稻小分子热激蛋白基因 Os02g0782500对逆境胁迫和激素的响应分析

【 目 的】 分 析 水 稻（Oryza sativa） 小 分 子 热 激 蛋 白（Small heat shock protein，sHSP） 基 因Os02g0782500 对逆境胁迫和激素的响应模式，为进一步研究 Os02g0782500 在逆境胁迫和激素响应过程中的功能提供理论依据。【方法】在水稻‘中花 11’中克隆获得 Os02g0782500，并对其进行生物信息学分析；同时利用定量 PCR（qRT-PCR）技术分析 Os02g0782500 在水稻不同组织及不同激素和非生物胁迫处理下的表达模式。【结果】Os02g0782500 编码区全长为 519 bp，编码一个含有 HSP20 保守结构域的 sHSP。系统进化分析显示，Os02g0782500 与玉米等单子叶植物中的同源蛋白亲缘关系较近。顺式作用元件分析表明，Os02g0782500 的启动子区含有 28 个植物激素响应元件和 35 个环境胁迫响应元件。qRT-PCR 分析表明，Os02g0782500 在水稻叶片中的表达量最高；且 Os02g0782500 的表达受 6-BA、GA3、IAA、高温、低温、PEG6000 和 NaCl 的诱导，推测其在水稻非生物胁迫响应过程中具有重要作用。【结论】明确了 Os02g0782500 的表达受高温、低温、6-BA、GA3和 IAA 等外界因素调控，推测 Os02g0782500 可能通过 IAA 等激素信号转导途径参与水稻的非生物胁迫响应。     

水杨酸和茉莉酸诱导水稻化感关键基因C4H的表达分析

[目的]肉桂酸-4-羟化酶(C4H)是苯丙烷合成途径次生代谢的重要酶,通过对不同化感潜力水稻中4个C4H基因:Os01g0820000、Os02g0467000、Os02g0467600、Os05g0320700的表达分析,研究它在不同化感潜力水稻中的区别,有助于揭示水稻化感抗(耐)性的内在机制。[方法]选用非化感水稻Lemont和化感水稻PI312777,进行水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)处理,通过q-PCR对4个C4H基因的表达进行分析比较,同时以水稻叶片水浸提液测定其对稗草根生长的影响。[结果]经过JA和SA处理的非化感水稻Lemont叶片水浸提液对稗草根生长的抑制率分别提高了22%和18%,而化感水稻PI312777的抑制率分别提高了40%和28%。q-PCR结果表明,JA和SA处理后,Os01g0820000和Os02g0467000在2种水稻中相对表达量相似;而Os02g0467600和Os05g0320700两个基因在PI312777中相对表达量上调程度均高于Lemont,表明这2个基因在PI312777中可能更多的参与到C4H的合成代谢。[结论]JA和SA处理后的2种水稻化感潜力增强,Os02g0467600和Os05g0320700在PI312777和Lemont中表达差异较大,因此推测这2个基因是造成2种水稻化感潜力不同的重要因素。     

胡杨悬浮细胞系的建立

[目的]建立快速稳定生长的胡杨(Populus euphratica Oliver)细胞悬浮系,为进一步制备胡杨原生质体及林木抗旱耐盐体细胞杂交育种研究奠定基础.[方法]以胡杨胚性愈伤组织为材料,建立胡杨悬浮细胞系,利用正交试验法优化悬浮细胞系的培养条件,在优化培养条件下测定细胞的生长特性.[结果]以胡杨胚性愈伤组织成功地建立了胡杨悬浮细胞系,正交优化试验表明:MB+0.1 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L 6-BA+50 g/L蔗糖+300mg/L CH+146 mg/L Gln为最优培养基组合,接种量为30 g(FW)/L时,干重增长速率最高,达 2.44 g/(L·d).胡杨悬浮细胞系生长曲线基本呈S形,生长周期为10 d,其中3～7 d为对数生长期.在一个生长周期内,培养液pH变化趋势是先下降,后上升并逐渐趋于平稳.[结论]在上述优化培养条件下,胡杨悬浮细胞系干重增长速率最快,细胞生长状态最佳.     

航天诱变高油酸甘蓝型油菜突变体分子标记的筛选

【目的】利用与候选基因FAD2紧密连锁的SSR标记对航天诱变的高油酸F2群体进行SSR标记分析,筛选与该高油酸性状紧密连锁的SSR标记及分析其突变位点。【方法】F2群体母本10L421为黄籽低油酸高亚麻酸自交系,父本10L422为航天诱变的高油酸低亚麻酸的突变株自交系后代。对4条染色体（A05、A01、C05及C01）上的候选基因FAD2上下游100 kb区域设计的148对SSR引物在两亲本、高低油酸混合池及F2群体中进行分析。亲本及群体油酸含量采用气相色谱分析,根据分子标记结果对F2群体油酸含量进行单标记分析。【结果】有36对引物在亲本间表现多态性,多态频率为24%。其中10对SSR引物在2个亲本和高油酸、低油酸极端群体间均具有相同的多态性。显著性检验和单标记分析表明,A05和A01上与FAD2共分离的SSR标记在0.01显著水平上与油酸性状相关,单标记分析分别解释表型变异31.1%和29.4%。【结论】A05和A01染色体上的FAD2是控制该突变体材料高油酸性状变异的主效位点,且该高油酸突变体是由于A05和A01上FAD2的双隐性突变所致。     

基于染色体片段置换系的野生稻粒长QTL——qGL12的精细定位

【目的】利用野生稻染色体片段置换系以及次级群体,精细定位与水稻粒长相关的QTL,发掘野生稻中影响粒长的新基因,为水稻育种提供遗传材料和基因资源。【方法】利用中国农业科学院作物科学研究所野生稻实验室已构建的野生稻染色体片段置换系群体,定位到一个与粒长相关的QTL——qGL12。在此基础上,选择粒长与受体亲本9311差异显著,且携带qGL12片段的置换系CSSL141与9311回交构建次级分离群体,设计区间内分子标记引物,筛选交换单株,结合粒型表型分析与基因型鉴定,对qGL12进行精细定位。通过扫描电子显微镜检测颖壳细胞,观察细胞的长宽变化,对定位区间内的基因进行基因注释以及测序分析,预测候选基因。【结果】根据整套置换系多个环境下的表型鉴定,qGL12初定位于第12染色体标记RM28621附近;选取携带qGL12的置换系CSSL141作为精细定位的亲本,CSSL141携带4个野生稻导入片段,在多年多点的田间试验中,CSSL141粒长、粒宽、粒重均明显高于9311;利用构建的CSSL141/9311 F2群体将qGL12定位于第12染色体标记RM5479与RM28621之间,影响粒长、粒宽以及粒重,对粒长的贡献率最高,为44.61%。在定位区间内设计了7个多态性分子标记引物,选择目标区间基因型杂合的植株种植F3,通过筛选交换单株,结合交换单株的基因型与表型,将qGL12定位于RM5479与RM28586之间50 kb区间内,为进一步缩短定位区间,在此区间内设计了4个多态性分子标记引物,选择交换单株种植下一代,筛选后得到20株交换单株,结合交换单株基因型与籽粒表型,最终将qGL12定位到第12染色体15.69 kb区间,该区间内有3个候选基因,其中Os12g39650编码一种微管蛋白,Os12g39660编码一种质膜钙转运ATP酶,Os12g39670尚未有明确功能,通过测序分析发现,Os12g39650、Os12g39660在编码区内存在变异;对亲本以及后代交换单株的颖壳细胞进行电镜扫描,发现9311颖壳细胞的长度与宽度均比CSSL141小,CSSL141/9311 F4代群体中,目标区间为野生稻基因型的交换单株颖壳细胞的长度与宽度均比目标区间为9311基因型的交换单株大,表明qGL12通过调控颖壳细胞的大小影响水稻粒长。【结论】利用野生稻染色体片段置换系,将野生稻粒长QTL——qGL12定位于第12染色体15.69 kb区间内,通过调控水稻颖壳细胞的大小影响粒长。该区间内有3个基因。来自野生稻的Os12g39650与Os12g39660与栽培稻等位基因相比,存在自然变异,确定为qGL12的候选基因。     

小麦2D染色体上多酚氧化酶（PPO）基因STS标记的开发与应用

 【目的】开发出小麦籽粒PPO活性的分子标记,并对新标记的应用进行研究,为面制食品外观品质的改良提供参考。【方法】根据一条由小麦2D染色体上PPO基因编码的mRNA序列（GenBank：AY515506）设计引物,对7个高PPO活性和7个低PPO活性小麦品种进行PCR扩增,筛选出有差异的引物,对130份小麦品种资源进行检测,验证不同带型与PPO活性的相关性,并利用一套中国春缺体、四体及双端体对STS标记进行染色体定位。在此基础上,结合一个位于小麦2A染色体上的PPO基因分子标记（PPO18）,对新开发的标记在小麦低PPO活性分子标记辅助选择中的作用进行评价。【结果】在AY515506的不同位置共设计了8对引物,其中一对引物（STS01）在高、低PPO活性材料中表现出多态性。该引物在7个低PPO活性的材料中能扩增出560 bp的目标片段,在7个高PPO活性的材料中没有扩增出目标片段,利用中国春缺体、四体及双端体最终将该标记定位在2D染色体长臂上。利用该标记检测130份小麦品种,结果表明有75个品种可以扩增出560 bp的目标片段,其PPO活性均值为221.08 A475/（min•g•103）;55个品种没有扩增出目标片段,PPO活性均值为309.98 A475/（min•g•103）,方差分析表明两者的差异达极显著水平（P＜0.01）。利用STS01和PPO18共同检测后发现,130份品种中,有37个品种的双标记扩增均表现出高活性带型（H1H2）,这些品种PPO活性的均值为337.82 A475/（min•g•103）,显著高于其它几种扩增带型品种的PPO活性均值（P＜0.01）。32个双标记扩增均表现为低活性带型（L1L2）的小麦品种PPO活性值普遍较低,可作为改良面制食品外观品质的候选亲本。【结论】STS01是一个位于小麦2D染色体长臂上PPO基因分子标记,可以在小麦PPO活性分子标记辅助选择中加以应用。     

磷脂酶C参与ParA1诱导的烟草悬浮细胞死亡和防卫反应

【目的】研究寄生疫霉Phytophthora parasitica分泌的蛋白激发子ParA1诱导烟草悬浮细胞后,磷脂酶C(phospholipase C,PLC)参与ParA1诱导烟草过敏细胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)和防卫反应。【方法】采用药理学方法,在烟草悬浮细胞中添加PLC抑制剂,比较烟草悬浮细胞受ParA1诱导后细胞死亡和多种防卫反应的差别。【结果】PLC特异性抑制剂U73122能完全抑制ParA1引起的烟草悬浮细胞死亡,氧迸发、胞外基质碱化和植保素scopoletin(7-羟基-6-甲氧基香豆素)积累都能显著地被抑制,5种防卫基因hin1、hsr203J、PR(pathogenesis-related)-1a、PR-1b和PAL等的转录表达也都受到U73122不同程度的抑制。【结论】ParA1处理烟草悬浮细胞后,PLC参与了ParA1诱导细胞死亡和防卫反应的信号传导过程。     

玉米大斑病菌转录因子StSte12的活性及其对酵母生长的功能互补分析

【目的】分析玉米大斑病菌StSte12的结构、转录活性及功能。【方法】利用生物信息学方法,对获得的StSte12进行保守结构域和进化树分析,推测该基因的功能;利用β-半乳糖苷酶法检测StSte12的转录活性;将StSTE12转化至酿酒酵母ScSTE12基因缺失突变体ste12Δ中,筛选酿酒酵母ScSTE12的功能互补突变体并对其分析,验证玉米大斑病菌StSTE12的功能。【结果】通过蛋白比对发现StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12具有转录激活活性;酵母互补试验表明,StSTE12可以回复酿酒酵母ste12Δ的功能,能够调控酵母细胞的生长。【结论】玉米大斑病菌StSTE12属于STE12-like基因;转录因子StSte12具有转录活性;对酵母细胞在YPD培养基上的侵入生长有重要的调控作用。     

新疆紫草毛状根愈伤组织诱导及其生长条件研究(Ⅰ)

[目的]建立以新疆紫草毛状根愈伤组织为基础的细胞悬浮体系.[方法]以新疆紫草毛状根为外植体,探讨激素、培养基、蔗糖、钙离子等对愈伤组织诱导、生长的影响.[结果]MS附加2,4-D 1.0 mg/L+ KT0.5 mg/L的愈伤组织诱导率为100;;钙离子浓度为250 mg/L时的B5 +6- BA0.1+ NAA 0.5愈伤鲜重最多,愈伤增殖倍数为9.63倍;愈伤组织在P-1中的生长量均较小,但愈伤的颜色普遍较红,当钙离子浓度为250mg/L、P-1附加1.0 mg/L KT的处理愈伤最红.[结论]毛状根是诱导新疆紫草的最佳外植体.研究为利用新疆紫草毛状根进行细胞悬浮培养提供了理论依据.     

影响禽致病性大肠杆菌信号分子AI-2产生的因素分析

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)在不同生长时期和不同培养条件下,信号分子AI-2(Autoinducer-2, AI-2)的合成与luxS和pfs的转录水平之间的关系。【方法】利用哈维弧菌BB170（vibrio harveyi BB170）检测不同生长时期和不同培养条件下APEC的AI-2活性。同时利用Real-time PCR检测APEC不同生长时期和不同培养条件下luxS和pfs的转录水平。【结果】APEC在不同生长时期的AI-2活性与luxS的转录水平保持一致。培养基中加入葡萄糖,麦芽糖和NaCl后,AI-2活性和luxS转录水平都上调,加入蔗糖后则都下调,两者保持一致性。AI-2活性与pfs的转录水平则并不一致。【结论】APEC的AI-2产生水平与luxS的转录水平有高度的相关性,而与pfs的转录水平没有显著相关性;葡萄糖、麦芽糖和NaCl,促进AI -2的合成。     

新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

[目的]建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础.[方法]取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15;～ 20;新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定.[结果]改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90;以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学(CK - 18)染色鉴定为阳性.[结论]改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法.