越冬白蜡虫微生物多样性分析

[目的]了解白蜡虫越冬时体内微生物的多样性,比较昆明与长春越冬虫体内微生物种类和数量的差异,为了解白蜡虫低温适应机制提供有用信息。[方法]采用Miseq高通量测序方法对昆明越冬雌成虫(KM)和长春越冬雌成虫(CC)体内细菌16s rRNA及真菌ITS基因进行测序,利用Usearch软件进行细菌和真菌OTU(Operational Taxonomic Unit)划分,并利用Mothur软件对OTU进行分类学分析和多样性指数分析。[结果]细菌KM和CC样品中共得到344个OTU,真菌KM和CC样品中共得到230个OTU。细菌共鉴定到15门、137属,在KM中乳球菌属占主要比例(29.78%),而在CC中立克次氏体占主要比例(55.77%),真菌中共鉴定到6门、83属,在KM中仅鉴定到41个属,而CC中鉴定到75个属,其中线虫草科无法归类的属在2个样品中均为优势菌群,但CC中含量远低于KM。[结论]昆明与长春越冬虫体内细菌及真菌种类和数量均不相同,与昆明越冬虫不同,需要应对极端低温的长春越冬虫体内立克次氏体为优势菌群。     

漆树黄化病病原类立克次氏体类型及超微结构

漆树是我国高山速生阔叶树种,至今未见有类立克次氏体研究报道。作者近二年在研究漆树病毒病时,从漆树叶脉黄化及微点状退绿的病叶组织中发现类立克次氏体。一、材料与方法病理切片取叶脉黄化型及微点状黄化型病叶的黄化退绿部位。将1mm~2病叶组织,经2.5％戊二醛,1％锇酸固定,PBS洗涤,酒精系列脱水,苯二甲酸二丙烯酯包埋,LKB-Ⅲ型超薄切片机切片,醋酸铀柠檬酸铅双染色,JEM-100型电子显微镜观察。     

一种新的白蜡虫寄生蜂体内Wolbachia的wsp基因分子检测及序列分析

采用Wolbachia的通用引物、A大组和B大组的特异性引物对一种新的白蜡虫寄生蜂--长尾啮小蜂(Aprostocetus sp.)体内Wolbachia的wsp基因进行分子检测,所获得的基因片段分别命名为wApr、wAprB和wAprB,长度分别为620、566和463bp;基因序列分析表明:wApA、wAprB与w...     

白蜡虫阔柄跳小蜂体内Wolbachia的wsp基因分子检测及序列分析

采用Wolbachia的通用引物对白蜡虫优势寄生蜂之一,白蜡虫阔柄跳小蜂(Metaphycus ericeriXu et Jiang)体内Wolbachia的wsp基因进行PCR扩增,以此为模板结合Wolbachia的A大组和B大组的特异性引物进行巢式PCR扩增,结果表明:白蜡虫阔柄跳小蜂被A大组和B大组Wolbachia复合感染,将两种寄生蜂感染的A大组和B大组Wolbachia基因片段以及采用通用引物获得的基因片段分别命名为wMeeriA、wMeeriB和wMeeri,对应的片段长度分别为554、439、599 bp。系统发育分析表明:白蜡虫阔柄跳小蜂感染的Wolbachia分属于A大组以及B大组的Con亚组。所获得的序列已经递交到NCBI,登录号分别为:HQ161162、HQ161163和HQ161164。     

文山松毛虫肠道微生物区系及其致病后的变异

试验表明:应用松毛虫质形多角体病毒感染文山松毛虫,可使松毛虫体内正常的微生物区系组成遭致破坏,从而影响松毛虫正常的代谢机能,提高了CPV的致病效果。     

羽脉山黄麻丛枝植原体的分子鉴定及病害调查

【目的】了解羽脉山黄麻丛枝病在云南省玉溪市新平县的发生情况和危害程度,通过分子生物学方法确定病原物及其分类地位,为本地区植原体防控提供参考。【方法】利用普查法获得病害发病率,评估病害危害程度。利用植原体通用引物P1/P7及R16F2n/R16R2对感病植株总DNA进行巢式PCR扩增、克隆和测序,得到16S r DNA序列。再用植原体在线分类鉴定工具i PhyClassifier以及MegaX软件分别进行序列分析和构建基于16S r DNA序列的系统进化树,确定病害病原物及其分类地位,通过在线分析软件MUSCLE比较相关序列的同源性。【结果】根据调查发现羽脉山黄麻丛枝病发生于大约101°35'—101°53'E和23°56'—24°20'N之间,主要是在低海拔400～600 m温度相对较高的干热河谷地区,说明高温有利于植原体病害的发生。该处连续3年发生此病害,2018年7月调查得知其平均发病率为38.9%,属中度危害。PCR扩增获得约1 246 bp的羽脉山黄麻丛枝病植原体16S r DNA序列(株系:TLWBYN01,登录号:MN513329)。分析表明TLWBYN01与翠菊黄化植原体(Candidatus Phytoplasma asteris)的参考菌株(M30790)相似度为99.8%,因此该植原体为‘Candidatus Phytoplasma asteris’相关菌株,属于16S r I组成员。TLWBYN01的F2nR2片段虚拟RFLP模型与16S r I-X亚组的参考模型番木瓜束顶植原体(登录号:JF781308)最为相似,相似系数为0.98,17种限制性内切酶的酶切图谱显示与16S r I-X参考株只有MseI不同,因此该植原体属于16S r I-X亚组的变种。比较得出TLWBYN01与16S r I-X亚组成员番木瓜束顶植原体(JF781308)和印度葫芦植原体(LT594117、LT594118)同源性分别为99.2%和99.6%。【结论】玉溪市新平县发现的羽脉山黄麻丛枝病属局部常发病害,中度危害,但一旦感染,就会严重影响植物生长。羽脉山黄麻丛枝植原体属16 Sr I组成员,也是报道较少的植原体16S r I-X亚组的一个变种,且羽脉山黄麻为新发现的植原体新寄主。     

荆条丛枝病植原体的分子检测及鉴定

植原体(Phytoplasma)是一类无细胞壁,迄今不能人工培养,存在于植物筛管细胞中的类似植物病原细菌的原核生物.据估计,植原体可在98个科,几百种植物上引起病害(Lee et al.,2000),主要症状包括丛枝、黄化、花变叶、花器退化等,严重时使植株提早衰老,直至整株枯死.     

9种瘿蚜的Wolbachia分子检测和系统发育分析

[目的]以五倍子蚜、杨树瘿蚜和黄连木瘿蚜等9种瘿蚜为实验材料,探讨瘿蚜Wolbachia与其它自由生活蚜虫携带的Wolbachia的株系差异及亲缘关系,明确五倍子蚜、杨树瘿蚜和黄连木瘿蚜等9种瘿蚜的Wolbachia感染情况、株系及系统发育关系。[方法]从田间采集新鲜虫瘿,将蚜虫转移到离心管内,100%乙醇-20℃保存。采用Wolbachia的16S rRNA、wsp、fts Z、gro E和glt A基因引物,以瘿蚜的总DNA为模板进行扩增、测序和分析,联合NCBI中Wolbachia 16S rRNA相关基因序列进行系统发育分析。[结果]在检测的9种瘿蚜中,有3种瘿蚜共3个种群感染有Wolbachia,其中滇叶瘿绵蚜昆明种群的Wolbachia属于B超群,肚倍蚜昆明种群和角倍蚜峨眉种群的Wolbachia可能属于新发现的O超群。[结论]与自由生活的蚜虫相比,瘿蚜的Wolbachia感染率偏低,且株系间的差异较大。     

白蜡虫脂酰辅酶A还原酶多克隆抗体的制备

白蜡虫脂酰辅酶A还原酶（FAR1）参与了体表蜡泌物的形成过程,为了进一步研究FAR1的功能,通过预测分析基因 far1 编码的蛋白结构,选取亲水性强、特异性好的一段合成多肽作为抗原肽,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以BCA蛋白浓度试剂盒测定抗体浓度,通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度,以ELISA检测抗体效价。结果表明,纯化所得的多克隆抗体纯度高,抗体浓度0.7 mg·mL^-1,抗体效价为 1：512 000,为后续FAR基因功能的研究奠定基础。     

白蜡虫孵化行为的研究

白蜡虫卵孵化主要受温度的影响，湿度和光照对其孵化行影响不大。白蜡虫卵在温度１２℃温度范围内卵都能孵化，以２０－２５℃条件下孵化率较高，达９５％左右。     

白蜡虫蜡酯合酶基因cDNA全长克隆及原核表达

正白蜡虫(Ericerus pela)是我国特有的资源昆虫,泌蜡是白蜡虫二龄雄虫最为特化的性状[1]。白蜡虫分泌的白蜡在食品、医药、纺织等行业具有重要的经济价值[2]。白蜡的主要成分是26酸26酯[3],已有研究表明,蜡酯的生物合成在动植物中存在保守途径[4]。蜡酯生物合成的第一步由脂酰辅酶A还原酶催化脂酰辅酶A转化为脂肪醇,第二步由蜡酯合酶(WS)催化脂肪醇和脂肪酸的酯化反应[5]。WS     

白蜡虫不同虫态及不同地理种群越冬雌成虫过冷却点的研究

对昆明地区白蜡虫不同虫态的过冷却点进行了测定,结果表明:昆明地区雄虫真蛹期过冷却点最低,中值为-15.81 ℃,符合正态分布;雌虫越冬时期过冷却点最低,中值为-20.41 ℃,符合正态分布;对于不同地理种群白蜡虫越冬雌成虫过冷却点的测定表明,长春地区越冬雌成虫在3月份过冷却点显著低于其它地区,过冷却点中值为-23.19 ℃,不符合正态分布。测定结果表明:白蜡虫在严寒地区抗寒能力增强。     

外源保幼激素类似物对白蜡虫泌蜡和发育的影响

[目的]探讨外源保幼激素类似物(JHA)对白蜡虫泌蜡和发育的影响。[方法]使用高、中、低浓度保幼激素类似物经喷施、涂干、注射处理白蜡虫2龄雄幼虫。[结果]表明:白蜡虫2龄雄幼虫经外源中等浓度保幼激素类似物(2.5 mg·m L-1)喷施处理可以显著提高白蜡虫2龄雄幼虫的个体泌蜡量,昆明地区增产率平均可达41.50%,峨眉地区增产率平均达25.56%;但此方法在2地区之间表现出差异性,原因可能与两地种虫来源所处的生态环境差异有关。在中、低浓度范围内,JHA对白蜡虫蛹体质量表现出促进作用,高浓度表现出抑制作用;JHA对蛹体长的抑制随着外源保幼激素浓度的增加而增强;外源保幼激素类似物还可以提高白蜡虫蛹的羽化率,羽化率达62.70%~81.62%。[结论]中浓度JHA(2.5 mg·m L-1)喷施处理2龄雄幼虫显著提高白蜡虫泌蜡量;白蜡虫蛹的体长与JHA浓度之间存在一定的负相关性;白蜡虫蛹的体质量表现出低浓度促进,高浓度抑制;喷施和涂干处理,高浓度可显著提高白蜡虫蛹的羽化率;白蜡虫蛹的羽化可能并不受其体质量和体长的影响。     

白蜡虫雄虫真蛹转录组分析

[目的]蛹期对于白蜡虫雄虫发育和交配具有重要意义,但目前缺乏对于白蜡虫真蛹基因转录情况的分析,本研究旨在获得白蜡虫真蛹转录组数据,了解其转录组特征。[方法]采用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,并进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3个热激蛋白基因(hsp)在不同虫态中的表达动态。[结果]共获得63 957条unigene、63 272个开放阅读框(ORF)、9 561个SSR分子标记,unigene平均长度674 bp,共有14 327条unigene获得了注释,Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)注释分析表明,很多基因参与的功能与白蜡虫蛹期的生理特征吻合。[结论]该转录组数据为白蜡虫基因功能鉴定和蛋白组学分析研究奠定了数据基础。     

白蜡虫热激蛋白基因在低温胁迫下的表达分析

白蜡虫对低温的高度耐受性对其生存、繁殖及白蜡生产都至关重要。为探讨低温胁迫对白蜡虫hsp表达的影响,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）,对白蜡虫二龄雄虫在低温胁迫下7个不同的 hsps（hsp21.5,hsp21.7,hsp40,hsp60,hsp70,hsc70,hsp90）的基因表达情况进行了检测。结果发现,除hsc70外,其余hsps均能被低温不同程度地诱导,其中hsp70、hsp21.7和hsp90的上调量十分显著。说明多数hsps都与白蜡虫幼虫应对低温胁迫相关。