三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)的检测效果, 首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度, 结果发现：3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测, 结果发现：黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明：常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病; 实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度; 巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点, 但操作较复杂, 适合技术熟练的研究者使用。     

柑橘黄龙病常规PCR检测技术研究与初步应用

柑橘黄龙病是世界范围具有毁灭性危害的柑橘细菌性病害,在我国大部分柑橘产区发生,严重制约了我国柑橘产业的发展。本文根据黄龙病病原物亚洲韧皮杆菌核糖体16SrRNA基因设计了1对PCR引物HLBF468/HLBR877,并以此为基础建立了常规PCR反应体系,确定了检测体系的特异性和灵敏度。结果表明该体系的检测灵敏度比先前报道的常规PCR方法有了明显提高。利用建立的PCR体系完成了对广东和广西两省区果园柑橘黄龙病的抽样检测。本研究建立的常规PCR方法可以作为一种简便、准确、灵敏的检测技术应用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

柑橘黄龙病PCR检测技术研究

以柑橘黄龙病病原亚洲菌系β-操纵子的特异引物fA2/rJ5进行PCR扩增,依据是否有目标DNA片段的产生来检测柑橘黄龙病菌的存在与否。该检测技术,具有快速、简便、灵敏等特点,可用于柑橘黄龙病的早期诊断,对控制该病害的传播具有重要意义。     

柑橘黄龙病PCR检测引物比较研究

柑橘黄龙病潜伏期长、尚无可用于大田的有效治疗药剂,快速、准确的早期检测是防控柑橘黄龙病的关键。PCR检测是目前柑橘黄龙病最常用的早期检测方法。为提高柑橘黄龙病PCR检测的准确性和检出率,本研究依据已测序的黄龙病菌全基因组序列对检测引物OI2c进行了改进（标记为OI2c-gj）,将其与其他常用的7对PCR检测引物进行了特异性和灵敏度的筛选和比较。结果表明,8对黄龙病PCR检测引物中,特异性较好的引物为OI1/OI2c-gj、Las606/LSS、P400F/P400R、A2/J5、16SF/16SR、primer1/primer2;灵敏度较好的引物从高到低依次为：OI1/OI2c-gj=Las606/LSS>P400F/P400R=A2/J5>16SF/16SR>primer1/primer2。综合比较引物特异性和灵敏度,本研究改进的引物OI1/OI2c-gj以及Las606/LSS、P400F/P400R、A2/J5对柑橘黄龙病检测有较好的准确性和检出率,建议用于柑橘黄龙病的早期检测。     

柑橘黄龙病症状与“Candidatus Liberibacter asiaticus”PCR检测结果的相关性分析

柑橘黄龙病症状较为复杂,且因寄主品种、生长期、病程等因素而异。利用PCR检测其病原菌"Candidatus Liberibacter spp."是目前柑橘黄龙病诊断的可靠方法之一。分析柑橘黄龙病症状与PCR检测结果的相关性有助于提高黄龙病的田间诊断准确率。本研究结果表明,与PCR检测相比,根据症状诊断柑橘黄龙病具有较高的假阳性率(8.20%)和假阴性率(50%);通过分析1 839个样品的症状与病原PCR检测结果发现,表现为斑驳型黄化、均匀黄化和"绿岛"这3种叶部症状以及"红鼻子果"和畸形果这2种果实症状的PCR病原检出率高;具有斑驳和黄化、黄化和"绿岛"、"绿岛"和花叶等复合症状样品的PCR检测"Ca.L.asiaticus"的阳性率最高;直径小于1 cm的幼果中的"Ca.L.asiaticus"检测稳定性低。这些结果为更准确地通过症状诊断柑橘黄龙病提供了科学依据。     

基于近红外技术柑橘黄龙病田间快速检测方法研究

柑橘黄龙病在感病植株和健康植株之间传播速度快,因此快速检测柑橘黄龙病对其防治十分关键。本文研究了近红外技术快速检测柑橘黄龙病的方法。采用PLS-LDA建立的模型对未参与建模的样品进行了检测,结果表明,该模型检测的准确率与普通PCR检测的结果符合率达到100%,假阳性率小于1%。该技术具有检测周期短、无污染等优点,可用于田间黄龙病的快速检测。     

海南省柑橘主产区黄龙病和病毒病的发生危害情况调研初报

柑橘是我国南方重要的水果之一,柑橘黄龙病和柑橘病毒病已经对我国柑橘的安全生产造成了严重威胁。为了解柑橘黄龙病和病毒病对海南柑橘产业的危害情况,本研究通过荧光定量PCR(Quantitative PCR)和反转录PCR(RT-PCR)分别对随机采集自海南柑橘主产区澄迈县3个福橙种植园和琼中县4个绿橙种植园共计109个样品进行了柑橘黄龙病和柑橘5种主要病毒病的检测。结果表明:澄迈县福橙标准化种植示范基地和琼中县营根镇绿橙种植园2个新植橘园的柑橘黄龙病发病较轻,检出率仅为8%和11%,而其他5个橘园的柑橘黄龙病检出率均在75%以上,严重的达100%。除此之外,7个橘园均未检测到柑橘褪绿矮缩病毒;澄迈县和琼中县的衰退病毒病检出率分别在52.9%和77.8%以上,黄脉病毒病在83.3%和90%以上。澄迈县还检测到碎叶病毒病的存在,检出率在38.1%以上,除红湖农场外还存在裂皮病毒病,检出率在11.8%以上。琼中县的绿橙种植园3还存在裂皮病毒病,检出率为43.8%。综上所述,柑橘黄龙病和病毒病已经严重威胁到海南省福橙和绿橙主产区的柑橘生产安全。加强对海南柑橘苗木安全生产的同时,亟需采取有效的田间综合防控措施,以促进海南柑橘产业的健康发展。     

三种分子检测体系的比较及柑橘果园黄龙病监测

为了评价3种PCR分子检测体系对柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,HLB)大田诊断效果,综合比较了常规PCR、巢式PCR和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(SG Ⅰ-qPCR)方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度、特异性和准确度等参数,并用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR监测广西柑橘园疑似HLB样品425个,比较了2种检测体系的阳性检出率。基于CQULA04F/CQULA04R引物对的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的灵敏度可达10 ag/μL;而巢式PCR灵敏度为100 ag/μL,巢式PCR较常规PCR检测灵敏度高104倍。疑似样品的HLB病原SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和巢式PCR检出率分别为46.6%、40.0%。各检测体系的灵敏性、特异性、符合度依次为SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR>巢式PCR>常规PCR。研究表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR可作为果园大规模HLB早期诊断和监测的首选,而在缺乏定量检测仪器时,巢式PCR也可用于HLB的检测,但需注意避免空气污染导致的假阳性。     

广东柑橘黄龙病发生情况与防控对策浅析

近年来,广东柑橘黄龙病为害较严重,威胁本省柑橘产业安全。从工作实践出发,对目前广东省柑橘黄龙病的发生情况及其为害蔓延的主要原因进行了分析,提出了加强柑橘黄龙病防控的对策措施。     

柑橘黄龙病的诊断及防控

柑橘黄龙病是世界性的柑橘细菌性病害.近两年,该病在贵州省锦屏县呈扩大蔓延趋势,给当地柑橘产业发展构成了极大的威胁.本文介绍了锦屏县柑橘黄龙病的发生情况,柑橘黄龙病的识别、诊断以及防控技术,以利于开展柑橘黄龙病的预防和控制.     

亚洲柑橘木虱的生物学研究进展及防治

亚洲柑橘木虱是柑橘黄龙病唯一传播媒介,柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,以目前科技水平还不能解决柑橘黄龙病的防治问题。通过控制亚洲柑橘木虱发生,降低柑橘黄龙病初传播风险和次生传播机率,是提高柑橘黄龙病防控水平的有效途径之一。本文从亚洲柑橘木虱形态特征、生物学特性、获菌与传菌能力、带菌率与带菌量、成虫在果园的分布规律、对柑橘品种的选择性,以及防控措施等方面进行了系统的概述,旨在为基层农技人员和广大柑橘种植者防控亚洲柑橘木虱与柑橘黄龙病提供参考。     

柑橘黄龙病菌核酸检测技术研究进展

候选韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）是一类通过虫媒传播，寄生于韧皮部的革兰氏阴性细菌，引起柑橘上的毁灭性病害——黄龙病（Huanglongbing,HLB）。柑橘感染黄龙病后在3～5年内便会衰亡或丧失结果能力，目前尚无有效防治药剂，果园若不及时在感染初期铲除病树，病害会在柑橘木虱的活动下迅速蔓延至整个果园，乃至摧毁整个地区的柑橘产业，造成不可估量的损失。培育无毒苗木、尽早发现和彻底铲除病树是防控柑橘黄龙病的关键，因此建立快速、精准的检测方法是防控黄龙病的基础。本文主要综述了柑橘黄龙病各种核酸检测方法及其优缺点，以期对建立更加灵敏、准确、高效的检测技术提供参考。     

景宁县柑橘黄龙病防控工作实践

柑橘黄龙病是目前尚无有效防治药剂的重大农业植物疫情,做好柑橘黄龙病防控工作,是保护一方柑橘安全生产的重要举措。景宁县自2003年被确诊发生该病伊始,启动了重大农业植物疫情防控应急预案,落实了各项防控扑灭措施,经过几年的努力,使得疫情的扩展蔓延势头得到了有效的遏制,防控工作取得了明显的效果。本文概述了景宁县柑橘黄龙病的防控工作实践。     

广东省柑橘黄龙病防控补贴试点工作初报

2012—2013年,广东省平远县开展了柑橘黄龙病防控补贴试点工作,初步探索建立了一套黄龙病防控工作机制,有力地推动了全县防控工作的开展,显著提高了防控效果,全县平均病株率由试点前的2%下降到1%以内。平远县黄龙病防控补贴试点的做法和成效对全省柑橘黄龙病等重大植物疫情的防控具有重要借鉴意义。     

黄岩橘区柑橘黄龙病防控体系实践及成效

为有效控制柑橘黄龙病发生危害,保护黄岩蜜橘产业可持续健康发展,本文调查了采取挖病树治木虱等综合措施果园与不挖病树不治木虱的发病果园2002—2019年柑橘黄龙病株发病率。结果表明综合防控果园2006—2012年当年株发病率在5%以下,2013—2019年当年株发病率却在1%以下;不挖病树不治木虱果园,2004年开始当年株发病率一直在7%以上,至2018年高达86.67%,达到彻底毁园程度。该结果也表明柑橘黄龙病防控应坚持行政措施与技术措施相结合,运用建立防控指挥、责任考核、经费保障、知识普及、监测预警与科学防控、病源清除、种苗监管和防控示范等八大体系,能够取得良好的社会经济生态效果,对提高广大农民防控柑橘黄龙病的信心和种橘积极性,保障柑橘安全生产有积极意义,对相似柑橘生产区开展柑橘黄龙病防控工作也有指导意义。     

湖北柑橘黄龙病的监测检疫与防控措施

为了促进柑橘产业的健康发展,本文介绍了不同季节柑橘黄龙病的发病症状,分析了其发病规律,提出了柑橘黄龙病的监测检疫与防控措施。     

海南柑橘黄龙病发生分布调查及病原种类鉴定

本研究在海南全省范围进行了柑橘黄龙病的发生分布调查和病原种类鉴定,共采集了14个市县62处柑橘种植点的不同柑橘品种样品1227份。用柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种rpIA-rpIJ基因片段的通用检测引物A2/J5和柑橘黄龙病菌美洲种16S rRNA基因片段的特异检测引物GB1/GB3,对样品进行PCR扩增,发现海南柑橘黄龙病的病原为柑橘黄龙病菌亚洲种,检测样品中阳性率为79.01%,未发现柑橘黄龙病菌非洲种和美洲种。结果发现,柑橘黄龙病已分布在海南的琼中、澄迈、儋州、琼海等8个市县。同时选取海南澄迈、儋州、琼海等4个市县有代表性的甜橙、柚子、柠檬感染黄龙病的样品,扩增样品的rpIA-rpIJ基因A2/J5片段,进行序列比对和系统进化分析。序列比对结果发现,海南各地不同品种中的柑橘黄龙病菌rpIA-rpIJ基因A2/J5片段序列一致性为99.87%,序列十分保守。系统进化分析表明,海南各地不同品种的柑橘黄龙病菌都与黄龙病菌亚洲种聚集为同一进化分枝,与黄龙病菌非洲种和美洲种分属不同的进化分枝。本研究明确了海南柑橘黄龙病的发生分布情况和病原种类,对柑橘黄龙病的防控具有重要的理论意义。     

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害, 目前没有可用的有效药剂和抗病品种, 分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价, 针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因, 构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明, 使用Es Taq MasterMix对感染 Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)的柑橘样品进行常规PCR检测时, 在评价的16对引物中, OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高, 推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系, 部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增, F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系, 且最高可稳定特异检出105倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-3 ng/μL）, 是灵敏度最高的引物组, OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-2 ng/μL）, 是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中, pnrdB83扩增效率最接近100%, 且在2次重复试验中波动最小, 稳定性最强, 并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时, 各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小, 是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。     

富川县柑橘黄龙病综合治理集成技术应用与推广

柑橘黄龙病主要是因从疫区调运或种植带毒苗木并由昆虫媒介柑橘木虱传播扩散。通过实施柑橘黄龙病综合防控项目,在项目基地采取集成技术对其进行综合防控,以项目带动集成技术大面积推广应用,全面提升柑橘黄龙病防控水平,保护和促进柑橘产业稳步发展。     

柑橘黄龙病的传播介体-柑橘木虱在广东果园的发生调查

柑橘木虱是重要害虫也是柑橘黄龙病的传播介体,因此调查木虱发生动态及其携带黄龙病菌的情况对指导黄龙病的防控有重要意义。本研究调查了广东多个果园的黄龙病发病情况,观察了柑橘木虱的生物学特性,统计了柑橘木虱在不同月份的发生数量,检测了木虱携带黄龙病菌情况。结果发现:失管果园中,黄龙病发病严重且木虱数量大,已成为散播病害的重要源头,而与失管果园保持一定距离且加强木虱防控可减轻黄龙病危害;还发现:广东地区6月份柑橘木虱种群已有一定数量,7、8月,其种群数量再次攀升,到了9、10月份,种群数量保持在高位。11、12月间,种群数量快速下降。最后根据本研究的调查结果,提出了一些加强黄龙病防控的措施。