‘Cocktail’葡萄柚黄龙病菌检测及鉴定

采用直接组织免疫印迹(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)和常规PCR技术,对采自广东梅州新建‘Cocktail’葡萄柚园内表现疑似黄龙病症状的样品进行检测。DTBIA检测发现疑似样品的韧皮部存在特征性紫红色反应,与黄龙病阳性对照反应一致。PCR检测发现枝条、叶片和果实样品中均检测出了黄龙病菌特异性条带,其中果蒂、中柱和种皮内病菌含量较高。进一步测序分析发现,来自‘Cocktail’葡萄柚病样的16Sr DNA和ef Tu基因与NCBI中的柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)对应基因的序列相似性均为100%,证实‘Cocktail’葡萄柚感染了柑橘黄龙病菌亚洲菌株。     

柑橘黄龙病菌在寄主体内含量动态变化研究

【目的】探索柑橘黄龙病流行规律,可以为果园柑橘管理提供指导,对延长柑橘黄龙病树的经济寿命具有重要意义。【方法】利用TaqMan qPCR荧光定量检测技术,从2017年8月至2018年10月监测江西赣州柑橘果园中黄龙病病原物的时间动态变化,结合气候数据分析柑橘黄龙病病原物与气候之间的相关性。【结果】柑橘黄龙病亚洲种含量年动态变化中,2017年8—11月和2018年5—7月有2个高峰,2018年4—5月和2018年7—8月会有2个低谷,整体呈现树冠北面枝条病菌含量高于南面,且症状严重程度与病菌含量呈反比。气候数据分析柑橘黄龙病菌含量与月下雨天数和月平均最高气温无相关性。【结论】果园中柑橘黄龙病亚洲种含量变化呈现一定规律消涨趋势,与以往的研究结果有相同之处,在10月存在高峰;柑橘体内亚洲种含量变化与温度和下雨天数这2个气候因子无相关性。     

柑橘黄龙病菌亚洲种的泛基因组分析

利用34个柑橘黄龙病菌亚洲种“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)基因组进行泛基因组（Pan-genome）构建,并对其进化和拷贝数变异（Copy number variations,CNV）等方面进行了深入分析。结果表明此泛基因组共含有36 593个基因,1 188个基因簇,其中核心基因簇有872个、可变基因簇271个和个体特有基因簇45个。对所有基因簇进行选择压力分析,发现159个基因簇经历了适应性进化。结合GO注释数据,本研究中挖掘出CLas中两个基因可能与致病性或治疗耐药性相关。对所有的基因簇进行拷贝数进行统计,同时深入分析其中8个基因簇,结果发现其中5个基因簇与CLas的致病性或抗性有关,因此推测拷贝数增加的基因可能与抗药性相关。     

柚新老枝叶中柑橘衰退病毒的DTBIA检测

应用直接组织印迹免疫法(Direct Tissue Blot Immuno-Assay,DTBIA)检测了中国农业科学院柑橘研究所品种资源圃的212株柚植株,呈柑橘衰退病毒阳性的有94株,占样品总量的44.3%.进一步对85株DTBIA阳性柚植株的新老枝叶进行检测,结果初步明确CTV在柚植株中存在不均匀分布现象,其中,新茎的平均CTV检出率最高,为77.9%,其次为新叶的77.1%;老叶和老茎的CTV检出率相对较低,分别为40.5%和38.7%.     

柑橘黄龙病菌侵染九里香不同方法研究

采用不同的方法将柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)传染到九里香(Murraya paniculata),运用Nested-PCR技术确认九里香是否感染黄龙病菌.结果表明,采用汁液摩擦、注射和挤压法,接种2个月后不能在九里香植株体内检测到黄龙病菌;黄龙病阳性接穗红江橙(Ci...     

葡萄根癌病菌的快速检测技术

根据葡萄根癌病菌核糖体基因间隔片段(16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Spacer,ITS)特异区域设计,合成了一对引物,建立了快速检测葡萄根癌病菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果表明:只有葡萄根癌病菌能扩增出大小为758 bp的特异性条带,而非葡萄根癌病菌均未能扩增出任何条带。检测灵敏度达10个细菌/μL左右,且稳定性好,经多次反复冻融,扩增条带未发现有明显变化。通过对田间病样进行检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速(4 h左右完成检测)、灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好等优点。     

中国柑橘黄龙病菌16S rDNA序列研究

 运用PCR技术对来自中国7省区不同寄主上的黄龙病菌16S rDNA基因区进行了PCR-RFLP-SSCP分析, 采用3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应,对酶切产物进行了单链构象多态性（SSCP）分析,结果表明来自7省区不同寄主上9个黄龙病病菌分离物的16S rDNA无可见变异;同时对9个代表性的分离物16S rDNA进行了克隆测序,序列多重比对结果与PCR-RFLP-SSCP一致,从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病菌的16S rDNA序列高度保守, 在不同的地域、寄主内没有发现分子变异,为进一步研究柑橘黄龙病菌系统进化奠定了基础。     

不同柑橘属种质对柑橘褐斑病菌的抗性评价

【目的】探讨不同柑橘种质及‘梨橙2号’ב晚蜜2号’部分杂交种对柑橘褐斑病菌Alternaria alternata的感病程度及抗性分级标准。【方法】采用室内果实去皮接种观察不同种质的感病程度并根据系统聚类分析法、病斑平均直径法、病情指数法3种抗性评价方法对抗病性进行分级。【结果】大部分宽皮柑橘类种质易感病;甜橙类、柚类和柠檬类种质较抗病。参试的54份种质划分为高抗、抗病、中抗、感病、高感5类,未发现免疫种质;‘胡柚’、‘强德勒’、‘华盛顿脐橙’和‘梁平柚’4个品种为高抗品种。‘梨橙2号’ב晚蜜2号’杂交种抗病性出现分离,可以进行遗传分析。【结论】宽皮柑橘种质及其杂交种和葡萄柚易感病。     

柑橘黄龙病田间快速检测技术研究（初报）

柑橘黄龙病是世界柑橘产区的重要检疫性细菌病害之一^[1],严重阻碍柑橘产业的健康持续发展。因抗性品种和特效药剂的缺乏,目前对柑橘黄龙病以预防为主,因此,加强病害的诊断和检测技术研究就显得尤为重要。PCR是一种有效的诊断技术,但需要熟练的技术人员,昂贵的仪器和试剂,不适合田间大规模的排查：症状诊断快速简便,但黄龙病的田间症状复杂多变,不同的生长季节在叶片、果实和植株上表现不同的症状,如从叶片斑驳到黄化、小叶、小果、青果、畸形果,种子褐变败育;     

花粉传播黄龙病可能性研究

为明确柑橘黄龙病能否通过授粉途径进行传播,研究采集了黄龙病发病沙田柚的花粉,将其授到6株健康温州蜜柑树的花上,定期观察被授粉树症状,并通过实时荧光定量PCR方法检测是否感染黄龙病菌.结果表明,授粉后30 d、60 d、90 d和180 d,被授粉树均生长正常,未出现黄龙病症状,也未从授粉树上检测出黄龙病菌.说明花粉传播...     

黄龙病菌胁迫下‘锦橙’CsCalS5表达和胼胝质沉积的初步分析

胼胝质合成酶是控制胼胝质合成的关键酶,在植物生长发育和抗逆胁迫中具有重要作用。克隆并分析‘锦橙’胼胝质合成酶基因CsCalS5及其启动子序列,实时荧光定量PCR检测CsCalS5的组织表达模式以及植物生长调节剂、黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的诱导表达模式,并通过组织切片观察感染黄龙病和柑橘溃疡病‘锦橙’叶脉胼胝质的沉积。结果显示,CsCalS5启动子序列中含有脱落酸和病原菌的响应元件;CsCalS5编码1 952个氨基酸含有保守结构域FKS1和β–1,3–葡聚糖合成酶功能域的跨膜蛋白;CsCalS5在‘锦橙’的茎中高表达,且受脱落酸的诱导;黄龙病菌侵染后叶脉韧皮部的胼胝质沉积明显,患病叶片CsCalS5的表达量是健康对照的4.02倍;柑橘溃疡病菌侵染叶片后,叶脉韧皮部胼胝质沉积无明显增加,且CsCalS5的表达量与健康对照无显著差异。综上,黄龙病菌可能通过上调‘锦橙’CsCalS5的表达促进韧皮部胼胝质的沉积,从而增强其防御能力,且这种抗性可能受到脱落酸的调控。     

黄龙病菌侵染晚锦橙叶脉和根早期病原蛋白组学的比较分析

[目的]黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,由于黄龙病病原菌无法离体培养,其关键的致病机制仍不清楚.为此,通过蛋白组学分析探究黄龙病菌侵染晚锦橙早期时病原蛋白的表达情况.[方法]利用叶圆片嫁接技术对晚锦橙(Citrus sinensis Osbeck)进行嫁接传毒,在传毒2个月...     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

应应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究

 以采自田间和广东省农业科学院果树研究所防虫隔离网室内嫁接并感染黄龙病的5 个柑橘品种叶片为材料, 以草本指示植物长春花( Catharanthus roseas) 和木本指示植物　柑( Citrus reticulata Blanco) 鉴定为基础, 采用改良的CTAB 法提取总DNA , 在此基础上进行常规PCR 与Nested-PCR 检测, 并对特异目的片段进行克隆、测序。试验证明Nested-PCR 比常规PCR 的灵敏度更高。这两种方法均可以检测出未显症的黄龙病材料, 但Nested-PCR 可以在木本指示植物嫁接后40 d 左右、草本指示植物摩擦接种1 个月左右检测到病原;而常规PCR 在木本植物嫁接后60 d 左右、草本植物摩擦接种近2 个月左右才能检测到病原。常规PCR 所能检测到的最低DNA 的量为pg 数量级; Nested-PCR 检测病原DNA 灵敏度约为常规PCR 的104 倍。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

我国柑桔生物技术研究进展

我国柑桔生物技术研究已有２０多年的发展,主要涉及四个方面：（１）胚和胚乳培养以及茎尖微芽嫁接等以解决育种和生产问题。（２）系统建立的基础性工作：原生质体培养与生理研究。（３）人工创造种质的研究：原生质体融合与转基因。（４）分子标记技术在柑桔研究中的应用。对近１０多年以来我国柑桔生物技术研究的进展作了全面的介绍。