中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

李属坏死环斑病毒辽宁桃树分离物基因组分析

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)辽宁桃树分离物全长基因组。用Vector NTI Advance 11软件进行基因组结构注释。用SDTv.1.0软件分析该分离物与Gen Bank中公布的其他PNRSV分离物间的核酸一致性,并用MEGA5.0软件和RDP3软件对各PNRSV分离物进行系统发育分析和重组分析。结果显示:PNRSV辽宁桃树分离物基因组由3条正义单链RNA组成。RNA1由3 332个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 30~3 167),编码一个约117.0k D的复制酶相关蛋白P1。RNA2由2 591个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 27~2 426),编码一个约99.0 k D的复制酶相关蛋白P2。RNA3由1 943个核苷酸构成,具有两个互不重叠的开放阅读框分别编码一个运动蛋白(nt 175~1 026)和一个外壳蛋白(nt 1 100~1 774),这两个开放阅读框的间隔区为73个核苷酸。PNRSV辽宁桃树分离物的RNA1、RNA2和RNA3与其他已经公布的PNRSV分离物间,核酸序列一致性分别为91.8%~98.8%,93.3%~99.2%和87.7%~99.0%。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列构建的系统发育进化树,分别将已报道的PNRSV分离物划分为3个、2个和3个组,PNRSV辽宁桃树分离物分别属于RNA1Ⅰ组、RNA2Ⅰ组和PV96组。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列进行的重组分析表明各PNRSV分离物基因组间不存在重组。PNRSV辽宁桃树分离物基因组序列是世界首个来源于桃树的PV96组基因组序列。     

四川地区猕猴桃病毒1的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒1（Actinidia virus 1,AcV-1）在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性,采用RT-PCR对来自四川6个地区疑似感染病毒的90份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明,22份样品为AcV-1阳性,检出率为24.4%。将获得的5个AcV-1分离物和已报道的新西兰分离物K75的外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列进行比对,结果表明,分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84.8% ~ 97.1%和89.7% ~ 99.6%,其中除邛崃分离物HYH5与新西兰分离物K75的核苷酸序列相似性较高（97.1%）外,其余4个分离物均低于91%。系统进化分析结果显示,这些分离物主要聚集在3个分支上,分离物HYH5与新西兰分离物K75位于同一分支,其余分离物位于另外2个分支。     

芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

 采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317 bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3% ~ 97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因（coat protein gene,cp）进行了测序,全长分别为951 bp和987 bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0% ~ 92.1%和74.8% ~ 98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。     

猕猴桃病毒A和B的RT-PCR检测及分子变异初步研究

为明确猕猴桃病毒A（Actinidia virus A,AcVA）和猕猴桃病毒B（Actinidia virus B,AcVB）在中国猕猴桃（Actinidia sp.）上的侵染状况和分子特性,采用RT-PCR技术对151份猕猴桃样品的AcVA和AcVB进行检测,检出率分别为15.2%和17.9%,所收集的6种猕猴桃样品中均检测到一种或两种病毒。发现AcVA的ORF1、ORF4和ORF5扩增片段序列存在较大分子变异,不同分离物的269 bp片段（ORF1）核苷酸序列相似性为77.3% ~ 99.3%。在基于各扩增片段核苷酸序列的系统进化树中,AcVA分离物聚为2 ~ 3组。采用引物AcVB5F/5R扩增获得20个AcVB分离物的342 bp或338 bp的ORF5片段,核苷酸序列相似性为81% ~ 100%,与新西兰AcVB分离物TP7-93B相应片段的核苷酸序列相似性为83.9% ~ 99.7%,在系统进化树中聚为3组。     

山东省芋花叶病毒病的田间调查及鉴定

为明确芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,Ds MV)在山东芋种植区的发生和遗传进化,在山东潍坊、青岛、烟台、日照和临沂等5个芋主栽区进行调查,对采集样品进行病毒病病原鉴定、序列分析和遗传进化分析。结果显示,芋花叶病毒的检出率为55.9%,在5个地区皆有分布。5个Ds MV分离物cp基因的核苷酸序列相似性为88.5%~91.9%,氨基酸序列相似性为93.4%~97.5%;与国内外已报道代表性Ds MV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性分别为74.8%~99.4%、79.7%~99.1%。遗传进化分析显示,Ds MV山东分离物与日本分离物(Ds23)、中国分离物(ND和ZAN)和美国分离物(Ds MV-U2)亲缘关系较近,聚在同一分支。综上,Ds MV在山东省芋主栽区发生普遍,其cp基因序列之间变异相对较大。     

百合斑驳病毒靖宇分离物全基因组序列测定与进化分析

以采自吉林省白山市靖宇县的野生百合感病叶片为试材，采用小RNA深度测序法检测到1株百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV),采用分段克隆方法，对LMoV靖宇分离物(LMoV-JY)的全基因组进行测定并分析，以期对吉林省百合病毒病的检测和防控提供参考依据。结果表明：LMoV-JY基因组大小为9 648个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号MT795719),该核苷酸序列在第154～9 444位存在1个大的开放阅读框(ORF),编码1个多聚蛋白(分子量351.46 kD)。LMoV-JY与GenBank中登录的其他LMoV分离物的全基因组核苷酸序列比较，其一致性为82.82%～97.85%,在氨基酸水平上的一致性为92.96%～98.64%,其中与百合斑驳病毒大连分离物LMoV-DL(HM222521)的一致性在该2种水平上均为最高。对比LMoV-JY外壳蛋白与其他54个分离物的氨基酸序列，发现可将LMoV分离物分为2个类群。     

侵染白菜的黄瓜花叶病毒分离物基因组的全序列分析

对浙江省杭州地区白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. commuis Tsen et Lee.）上获得的CMV分离物（CMV-CTL）进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示：CMV-CTL的RNA1（GenBank序列号：EF213023）全长为3357个核苷酸（nt）,编码993个氨基酸（aa）的1a蛋白;RNA2 （GenBank序列号：EF213024）全长为3047 nt ,编码858 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白;RNA3 （GenBank序列号：EF213025）全长为2217 nt,编码278 aa的MP蛋白和218 aa的CP蛋白。序列相似性分析表明,CMV-CTL与CMV亚组IB中株系IA相似性最高,RNA 1、RNA 2和RNA3与该株系的相似性分别为91.3%、91.3%和93.6%。CP基因和RNA 3 的5' NTR核酸序列系统发生树分析表明,CMV-CTL与中国大多数CMV分离物一样,属于CMV亚组IB。     

香蕉束顶病毒DNA组分的克隆及其重要特征序列分析(英文)

克隆得到1条新的香蕉束顶病毒(BBTV)6核苷酸全序列,对其进行序列分析发现,该序列含有2个主要的特征序列CR-SL(Stem-loop common regions)和CR-M(Major common regions)。BBTV6氨基酸进化树结果显示其分成2大类。将6种BBTV组分的序列进行比较发现,6种组分内核苷酸和氨基酸的最高相似性分别为96.10%和98.27%,6种组分间核苷酸和氨基酸最高相似性分别为70.78%和56.24%。6种BBTV组分的核苷酸及其氨基酸进化树将所有分离物按照组分类别分成6组,而6种BBTV组分的CR-M核苷酸序列进化树将所有的分离物按照地域分成2大类。对BBTV的6种组分的蛋白质进行分析,结果表明,各种组分蛋白质的二级结构和理化性质有明显的差异。     

贵州辣椒叶脉黄化病毒分离物检测及其P0、CP、MP基因进化分析

为明确辣椒叶脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus,PeVYV）在贵州辣椒上的发生分布及其分子变异情况。用RT-PCR法对采自贵州省25个采样地点的548份辣椒疑似病毒病样品进行检测。结果表明：129份为阳性样品,检出率为23.54%。将获得的14个不同采样点PeVYV分离物和已报道的中国和其他国家PeVYV分离物进行序列比对,P0基因核苷酸同源性为90.9% ~ 100.0%,氨基酸相似性为97.7% ~ 100.0%;CP基因核苷酸同源性为93.7% ~ 100.0%,氨基酸相似性为97.9% ~ 100.0%;MP基因核苷酸同源性为94.7% ~ 100.0%,氨基酸相似性均为100.0%。在系统进化树中,有13个采样点PeVYV分离物P0基因聚在一起,与中国分离物（KP326573）的亲缘关系较近,而遵义播州PeVYV分离物与澳大利亚分离物的亲缘关系较近。贵州所有PeVYV分离物CP基因与中国、澳大利亚、美国和西班牙分离物聚为一支,但不同采样点的PeVYV分离物又聚为两个不同的分支。而不同采样点MP基因全部聚在一起,且与其他地区PeVYV分离物的差异不明显。研究结果表明贵州辣椒上不同地区PeVYV分离物具有一定的分子差异,存在遗传分化现象。     

侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物（ChiVMV-GD）的基因组全序列,结果表明,除poly（A）尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白（位于167 ~ 9 436 nt）,5′–非编码区（5′-UTR）和3′–非编码区（3′-UTR）分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白（VPg）,3′–末端含有poly（A）尾。序列同源性分析结果表明：ChiVMV-GD与ChiVMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1% ~ 96.9%,其中与来自中国海南分离物（登录号：GQ981316.1）的同源率最高（96.9%）。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。     

瓜类蚜传黄化病毒在南疆的检测及系统进化

2019年从南疆7个县/市采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)侵染典型特征的47份甜瓜叶片样品,通过RT-PCR进行CABYV的检测,从县/市各选出1份代表性样本,进行特异性片段的克隆、测序,以及核苷酸多样性、蛋白序列和系统发育分析。结果显示,28份样本呈现CABYV阳性,检出率为59.57%,巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县、洛浦县的检出率分别为80.00%、28.57%、83.33%、60.00%、37.50%、71.42%、66.67%。克隆测序获得了707 bp的核酸序列,核苷酸多样性值在0.012～0.018之间,所有序列均具有2个开放阅读框(ORF)。ORF1编码199个氨基酸的外壳蛋白(CP),各县/市的序列相似性为99.07%。ORF2编码191个氨基酸的运动蛋白(MP),各县/市的序列相似性为98.80%。基于CP和MP序列构建的系统发育树表明,各县/市得到的所有CP和MP均聚在亚洲分支。CABYV在南疆甜瓜主产区普遍发生,且不同区域核苷酸变异很低,这些地区的CABYV与中国及日本分离物的亲缘关系较近,而与欧洲及中国台湾分离物的亲缘关系较远。     

小西葫芦黄花叶病毒山东南瓜和丝瓜分离物全基因组序列分析

在山东泰安采集到两个表现黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV);通过RT-PCR和RACE方法获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17(丝瓜分离物)和CN:Lc:17(南瓜分离物)。结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly(A)尾巴外,分别含有9 593和9 591个核苷酸(Nucleotides,nt),通过多聚蛋白策略编码一个含3080个氨基酸的多聚蛋白。CN:Cm:17和CN:Lc:17在氨基酸水平上一致率为96.7%;CN:Cm:17与韩国分离物KR:RDA:07的氨基酸一致率最高(97.8%); CN:Lc:17与CN:CJLX30535:14和CN:spider131932:13的一致率最高(98.4%)。重组分析发现,CN:Lc:17具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,所有中国分离物分别聚集在A-Ⅴ和A-Ⅵ亚组。     

广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多样性分析

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害广东省冬瓜的常见病毒。摸索了冬瓜叶片总RNA最佳提取方法,通过基于ZYMV病毒外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列的RT-PCR扩增,检测采集自广东省9个冬瓜产区的76份病毒侵染样品的病毒田间发病率;将扩增产物克隆测序,利用MegAlign软件构建系统发育进化树分析cp基因遗传变异与系统进化。结果表明,24份样品检测为阳性,田间发病率为31.59%;所有参试病毒分离物cp基因全长840 bp,编码279个氨基酸的多肽;测序的16个分离物cp基因的核苷酸序列与推导蛋白的氨基酸序列相似性分别为98.1%~100%与96.1%~100%;所有广东分离物的推导氨基酸序列基序保守,除GD121-9增加2个人类白细胞抗原外,其他均包含5个人类白细胞抗原及1个N糖基化位点,均包含保守potyv_CP功能域及与病毒蚜传相关的结构域DAG三联盒"Asp-Ala-Gly";系统进化分析表明,ZYMV病毒划分为7个基因型,广东分离物均属于同一基因型Ⅰ,包含3个株系;广东地区的16个分离物分为3组,无明显地域选择性。总体上广东ZYMV-cp比较保守,分子变异较小。明确了广东省冬瓜上ZYMV病毒的侵染情况及外壳蛋白基因的变异特点,为对其致病性和抗病毒基因工程等研究提供依据。     

浙江柑橘产区柑橘黄脉病毒的发生、分布与分子特性研究

运用RT-PCR技术对采自浙江12个柑橘产地的181份柑橘样品进行检测,首次从浙江的‘佛手’柑(Citrus bergamia)和‘红美人’橘(C.reticulata)上检测出柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),其检出率分别为68.0%和47.2%。选取4个CYVCV毒株与11个已知CYVCV毒株进行全序列分析,结果显示CYVCV序列保守性较高,所有15个CYVCV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.9%~99.8%和97.9%~99.4%。虽然采自浙江的4个CYVCV毒株在进化树中聚成单独的簇,但CYVCV毒株间的亲缘关系可能不与其采样地的存在相关性。     

胡葱黄条病毒吉林毛葱分离物全基因组序列测定与分析

使用RT-PCR方法从吉林省疑似感染胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus,SYSV)的分蘖洋葱(毛葱)叶片中获得了SYSV吉林毛葱分离物SYSV-JL(MN607702)的全基因组序列。SYSV-JL的全长序列为10?427 nt,与GenBank已登录的3条SYSV全长或近全长序列在多个基因上保持着较高的序列一致性,但在P1基因上核苷酸和氨基酸序列一致性较低,分别为69.5%～84.2%和60.9%～76.9%,进一步通过变异分析发现,P1基因包含369个变异位点,表现出较为明显的高变异特征。系统发育分析显示,不同SYSV分离物具有较为明显的地区差异,SYSV-JL分离物与多个中国分离物系统发育关系较近。