苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11（序列号 MDP0000756341）。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11(序列号MDP0000756341)。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸(ABA)、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

苹果磷酸果糖激酶基因MdPFPβ调控果实可溶性糖积累的功能

为阐明苹果（Malus×domestica Borkh.）磷酸果糖激酶基因MdPFPβ(Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase subunit beta,基因序列号MD09G1112800)的生物学功能,首先分析了基因启动子和全长序列信息,该基因包含全长为483 bp完整的开放阅读框,编码161个氨基酸。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件分析发现,MdPFPβ启动子序列中含有与脱落酸（abscisicacid,ABA）、低温及干旱信号相关的调控元件。荧光定量PCR分析发现,MdPFPβ在苹果叶片和成熟果实中表达量较高,并且受外源ABA的诱导表达。在外施ABA的条件下,MdPFPβ过量表达的苹果愈伤组织中可溶性糖含量明显上升。此外,MdPFPβ转基因番茄植株的光合性能增强,MdPFPβ可能通过调控糖代谢酶的活性最终影响果实中的可溶性糖含量。     

苹果bZIP转录因子基因MdAREB2功能的初步研究

对‘嘎拉’苹果中的1个bZIP转录因子基因MdAREB2(序列号:MDP0000248567)进行功能初步研究。蛋白进化树分析表明,苹果MdAREB2与拟南芥AtAREB2具有很高的同源性。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析,MdAREB2启动子序列中存在脱落酸响应元件ABRE。实时定量PCR检测表明,MdAREB2明显受ABA诱导。拟南芥种子萌发阶段经过0.5和2μmol·L~(-1)ABA处理后发现突变体abi5中过量表达MdAREB2能够恢复对ABA的敏感性。拟南芥幼苗生长阶段,经过20μmol·L~(-1) ABA处理后发现,突变体abi5中过量表达MdAREB2能够部分恢复对ABA的敏感性。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

百子莲脱水素基因ApSK_3对逆境与激素信号的应答模式与调控机制

克隆了百子莲(Agapanthus praecox)脱水素基因ApSK_3上游2 195 bp的启动子序列,对百子莲不同组织和多种非生物胁迫与ABA处理的样品进行基因定量分析,构建多个ApSK_3不同长度缺失的启动子片段与GUS基因融合的表达载体并转化拟南芥,以揭示ApSK_3基因对不同逆境与激素信号的应答模式及顺式作用元件的调控功能。结果表明:ApSK_3启动子序列包含多个与植物逆境、激素应答及生长发育相关的顺式作用元件,且ApSK_3的表达具有组织特异性,果实中表达量最高,叶、根次之,花中最低;ApSK_3对ABA信号与盐胁迫最敏感,其次为干旱、高渗和低温胁迫,对高温胁迫响应不明显。ApSK_3-P::GUS融合表达载体转化拟南芥,ApSK_3启动子在拟南芥的整个生长发育过程中均具有较强的表达活性,幼苗根部的表达活性强于叶片,且随着果实的发育成熟启动子的活性明显增强。ApSK_3不同长度缺失的启动子片段分析结果表明–2 175～–950 bp片段对启动子的活性起到重要的调控作用;多个顺式作用元件响应干旱胁迫;ApSK_3-P通过两个ABRE元件共同响应ABA信号;–526～–533 bp的ERE元件参与响应乙烯信号;–561～–567 bp的P-box元件响应了赤霉素信号,–2 175～–1 167 bp区域可以增强对GA的响应。研究结果证明ApSK_3启动子可积极响应干旱、渗透、盐、低温、ABA、GA和乙烯信号;启动子上存在多个顺式作用元件响应干旱胁迫,ApSK_3-P通过两个ABRE、ERE与P-box元件分别响应ABA、乙烯与赤霉素信号。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

龙眼GDSL酯酶/脂肪酶基因的全基因组鉴定及表达分析

基于第三代龙眼基因组数据库及其转录组数据库,通过生物信息学分析对龙眼GDSL酯酶/脂肪酶家族进行全基因组鉴定。结果显示龙眼GDSL(Dl GDSL)家族共有118个成员,分为15个亚家族,亚细胞定位显示主要分布于细胞外基质中。染色体位置及共线性基因分析表明,118个Dl GDSL基因中有111个定位在15条龙眼染色体上,包括13对共线性基因。基因结构和蛋白质保守基序分析表明该家族的外显子在2～12之间,且motif2和motif3是Dl GDSL家族中尤为重要的保守基序。启动子顺式作用元件分析表明,启动子序列中包含众多光响应、激素应答、无氧诱导、胁迫响应和昼夜节律等响应元件,且大部分成员都含有茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)等激素应答作用元件。FPKM值分析发现从胚性愈伤组织到球形胚阶段有26个差异表达的基因,提示Dl GDSL家族部分成员可能在龙眼体胚形态建成中发挥重要作用。q RT-PCR分析表明,在外源ABA和Me JA处理下龙眼胚性愈伤组织中,Dl GDSL家族部分成员可能与ABA、Me JA等激素信号转导相关。     

过表达苹果多肽激素基因MdCEP1促进花青苷积累

以‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)愈伤组织为试材,初步探讨苹果多肽激素Md CEP1(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1)在调控花青苷合成方面的作用。分析显示Md CEP1位于苹果第15号染色体,只有1个外显子。蛋白序列比对显示不同物种中CEP结构域非常保守。启动子分析表明,Md CEP1启动子序列包含多个顺式作用元件,包括与分生组织有关的CAT-box元件、赤霉素响应元件(P-box)、光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。通过农杆菌介导的遗传转化获得Md CEP1转基因苹果愈伤组织,进一步分析发现过表达Md CEP1能够明显促进愈伤组织花青苷积累,并且促进花青苷合成相关基因的表达。Md CEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析

 为了分析WRKY40抗病抗逆作用,以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）Rehd.]为试材,利用特异引物进行RT-PCR基因克隆,利用实时荧光定量PCR方法分析组织中基因的表达及低温、高盐、干旱、PEG6000胁迫和外源IAA、ABA处理对基因表达的影响。结果表明,克隆到的片段长度为1 240 bp,包含一个完整的开放阅读框,长999 bp,编码333个氨基酸。该基因与拟南芥AtWRKY40同源,故命名为MhWRKY40b,GenBank登录号为JX112913。基因表达分析表明,MhWRKY40b在根、茎、叶等组织均有表达,其中在花萼、花辨、果实中表达量较高。该基因明显受低温、高盐、干旱胁迫诱导表达,最高相对表达量可达20倍以上;而受PEG、苹果白粉病菌及外源ABA和IAA轻微诱导,最高相对表达量在10倍以下。MhWRKY40b除了在抗白粉病方面与AtWRKY40具有相似功能外,可能还在湖北海棠的抗寒、抗盐、抗旱过程中起到比较重要的作用。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

苹果蛋白磷酸酶基因MdPP2C-Like的克隆及其对ABA的响应分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材,克隆了ABA信号转导过程中的响应基因蛋白磷酸酶基因MdPP2C-Like（基因序列号 MDP0000126636）。基因结构分析显示,MdPP2C-Like定位于苹果8号染色体上,含有5个外显子与4个内含子;该基因全长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测其蛋白质分子量为37.84 kD,等电点（pI）为5.72。蛋白质结构分析发现,其存在1个蛋白磷酸酶2C（PP2C）保守结构域,并与拟南芥中的A类PP2C保守结构域高度同源。构建的系统进化树表明MdPP2C-Like与At4G32950位于同一进化支,同源性较高。亚细胞定位结果表明,MdPP2C-Like主要定位于细胞核,少数分布在细胞质。定量分析显示,MdPP2C-Like在苹果不同组织中表达量不同,根中表达量较高。对获得的转基因拟南芥株系和苹果愈伤组织进行ABA响应分析,结果表明该基因的过量表达降低了植株和愈伤组织对ABA的敏感性。以上结果表明,克隆得到的MdPP2C-Like在响应ABA信号过程中起着重要作用。     

苹果顶芽中内源激素动态与成花关系研究

用环切处理后的16年生金冠苹果树的顶芽甲醇提取物进行IAA、GA和ABA类物质的分离、纯化和鉴定。结果发现,5～7月IAA、GA类物质含量下降、ABA上升。环切后10天三种激素含量依次为对照的66％、43％和230％。环切后10～45天三种激素含量保持与对照有稳定的显著性差异(IAA、GA低于对照,ABA高于对照)。因此认为在花芽生理分化过程中,IAA和GA的低含量与ABA的较高含量对成花有促进作用;反之,则抑制成花。环切促进成花的原初过程或诱导因子是内源激素及其平衡状态的改变。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。