查尔酮合酶基因对桃果实花色苷代谢的影响

从桃（Prunus persica）果皮中克隆了493 bp的查耳酮合酶（Chalcone Synthase,CHS）基因片段,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）构建干扰载体TRV-LIC-CHSi,通过农杆菌渗入法沉默目的基因CHS的表达,从而研究CHS在桃果实花色苷代谢途径中的功能。干扰CHS基因的表达后,CHS的表达量降低88.8%,果皮中花青素糖苷含量下降87%,槲皮素糖苷含量下降35%,绿原酸含量升高57%,原花青素含量、儿茶素含量和山奈酚糖苷含量无显著变化。研究结果表明,沉默CHS基因,会使整个花色苷代谢途径转向绿原酸及其复合物方向。CHS基因调控着类黄酮类物质的代谢方向,是花色苷代谢途径中的重要基因。     

李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是在桃（Prunus persica）上进行基因沉默的主要手段，现有VIGS体系效率较低，亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase）基因PpPDS为指示基因，探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明，在侵染方式上，叶片注射是有效的方式；李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）载体（pCaRNA1/2和pCaRNA3）优于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）改造后的TRV载体（pTRV1和pTRV2）；温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高；苗龄为5～6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高，达到85%；菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数，选择桃叶绿素合成基因（PpGluTR和PpPOR）为目标基因进行验证，结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制，叶片颜色变化明显。这些结果表明优化...     

牡丹NCED 基因的克隆和表达分析

 通过RT-PCR和RACE技术克隆得到了牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）中编码9–顺式–环氧类胡萝卜素加双氧酶蛋白（NCED）的一条cDNA基因全长（暂命名为Ps-NCED1）。进化树分析显示Ps-NCED1的氨基酸序列与葡萄、马铃薯、胡萝卜等植物中的NCED一致性均达到了70%以上。通过与拟南芥中CCD（类胡萝卜素分解加双氧酶）家族氨基酸序列比对后发现,Ps-NCED1与调控ABA合成的At-NCED3一致性最高。对花朵中内源ABA的研究发现,ABA在花朵蕾期及衰老期含量较高,盛开期时含量较低,表明ABA对于植物的开放衰老具有促进作用。相对荧光定量PCR分析发现：在花朵完全开放的牡丹植株中,Ps-NCED1在根、茎、叶、花托、萼片、花瓣、心皮、雄蕊中的表达量以在根和雄蕊中较高,在叶和萼片中最低。在外源ABA处理的牡丹花瓣中,Ps-NCED1表达量变化与内源ABA含量变化具有相同的趋势,推测该基因是调控内源ABA含量的主要基因。     

红花草莓‘莓红’花瓣花色苷积累及其MYB基因的表达分析

以红花草莓品种‘莓红’为研究材料,观察花瓣发育过程中色泽及花色苷变化规律,同时对4个发育时期花瓣进行转录组测序,基于相关性筛选花色苷合成途径的关键功能基因及转录调控因子,结果表明:(1)花瓣发育过程中,花色苷总含量呈先升后降趋势,且在半开期达到最高;(2)花色苷合成途径关键功能基因FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaDFR、Fa3GT表达水平与花色苷含量正相关;(3)R2R3-MYB基因FaMYB6和FaMYB90与花色苷含量呈正相关;(4)Pearson相关性分析表明FaMYB6与FaPAL、FaDFR显著正相关,FaMYB90与FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaDFR、Fa3GT极显著正相关,Fa MYB82则与上述5个结构基因之间均极显著负相关。综上,‘莓红’草莓花瓣发育过程中,花色苷积累引起花瓣颜色变红,FaMYB82、FaMYB6、FaMYB90可能通过调节FaPAL、Fa4CL、FaDFR和Fa3GT的表达来调控花瓣色泽形成。     

迎红杜鹃的花色素组成及花色在开花过程中的变化

分析了迎红杜鹃（Rhododendron mucronulatum Turcz.）的花色素组成,调查了其在开花过程中花色、花色素组成和含量的变化。采用英国皇家园艺学会比色卡和分光色差计测量了不同开花阶段的花色。结果表明,开花过程中花色的明度增加,彩度变小,由红紫（70B）变为淡紫红色（84B）。用高效液相色谱—光电二极管阵列检测技术（HPLC - PAD）和高效液相色谱—电喷雾离子化—质谱联用技术（HPLC - ESI - MS）分析花瓣中花青苷和黄酮醇的组成及含量。在520 nm和350 nm波长下,共检测到15种化合物：5种花青苷、8种黄酮醇和2种芳香酸,推定出了其中10种化合物。花青苷：锦葵素 3-阿拉伯糖苷-5-葡萄糖苷;黄酮醇：杨梅黄素3-半乳糖苷和杨梅黄素3-鼠李糖苷;槲皮素3-半乳糖苷、槲皮素3-葡萄糖苷和两种槲皮素-鼠李糖苷以及山奈酚3-鼠李糖苷;芳香酸：绿原酸及其异构体。未检测到酰基化色素及5-O-甲基化黄酮醇。在6个开花阶段中,虽然花色变化明显,但花色素种类不变,其含量在各阶段差异极显著。从小蕾期到初开期,总花青苷含量（TA）和总黄酮醇含量（TF）迅速减少,花开放后变化平稳。基于花色素组成信息,探讨了耐寒杜鹃的花色育种策略。     

病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析

 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

月季茉莉酸羧基甲基转移酶基因RhJMT对花瓣衰老的调控

为了解茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）在花瓣衰老中的作用机制，以月季‘Samantha’为材料，在花瓣中克隆了MeJA生物合成关键酶茉莉酸羧基甲基转移酶（jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT）基因RhJMT。同源蛋白序列比对和系统进化树分析表明，RhJMT具有保守的Methylyransf＿7超家族结构域，属于SABATH蛋白家族。实时荧光定量PCR结果表明，RhJMT的表达量在花瓣进入衰老期后显著升高。通过病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术对RhJMT进行功能验证，结果表明沉默RhJMT显著延缓花瓣衰老，外源施加MeJA能够抵消沉默RhJMT对花瓣衰老的延缓作用。以上结果说明RhJMT能够促进花瓣衰老，可能是通过控制MeJA的含量来发挥作用。     

利用红外光谱研究‘凤丹白’牡丹花瓣伸展过程中物质变化

为了明确花瓣的伸展机制,以‘凤丹白’牡丹(Paeonia ostii)为研究对象,借助傅里叶变换红外光谱(Fourier Transformation Infrared Spectroscopy,FTIR)及高斯多峰拟合,分析蕾期、初开期和盛开期花瓣的波谱特征及蛋白质二级结构的差异性。主要结果如下:随着花朵开放花瓣伸展,777、1 105、1 155、1 243、1 447、1 651、1 740、2 853和2 926 cm~(-1)处的振动峰振动依次增强,表明磷脂质、核酸、脂类和蛋白质等代谢物质随花瓣的伸展逐渐增强;且蕾期1 030 cm~(-1)处的振动峰在花开后移至1 060 cm~(-1),表明蕾期花瓣细胞壁多糖以甘露聚糖为主,花朵开放后则以阿拉伯糖为主。蛋白质中甲基基团含量(A2 951 cm~(-1)/A 2 858 cm~(-1))出现平稳下降的趋势,初开期比蕾期减少7.97%,盛开期减少13.38%;糖蛋白的变化(A 1 083 cm~(-1)/A 1 547 cm~(-1))也呈现下降趋势,推测‘凤丹白’牡丹是通过蛋白质糖基化作用调控花瓣的伸展过程。对氨基Ⅰ区域(1 600~1 700 cm~(-1))高斯多峰拟合数据显示,各阶段花瓣中均含有果胶相连的β–折叠、β–折叠、无规卷曲、α–螺旋及环与转角;α–螺旋、β–折叠及无规卷曲所占比例在花瓣伸展过程中呈现增长趋势,表明蕾期花瓣通过降低α–螺旋应对缺水造成的生理胁迫,并可以利用ATP合成花瓣生长发育所需的物质;花瓣通过形成更多功能域较多的蛋白质,有效调控花瓣伸展时复杂的生物化学过程。     

不同花色牡丹品种花瓣色素含量及成分分析

以分属白、粉、红3个色系的6个牡丹品种花瓣为试材,采用薄层层析色谱法(TLC)、紫外-可见分光光度计(UV)和高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)研究不同花色牡丹品种花瓣中的色素含量,并进行了定性分析。结果表明:粉色和红色系牡丹中检测出2种花青苷,分别是矢车菊素-3,5-二葡糖苷和芍药花素-3,5-二葡糖苷,白色系牡丹中未检测到花青苷类物质,其中矢车菊素-3,5-二葡糖苷在粉色系牡丹中含量较高,而红色系中总黄酮和总花青苷的含量最高。     

观赏海棠花色时序动态分布格局研究

 采用X-Rite 色差计对97 个观赏海棠品种大蕾期（S₁）、盛开期（S₂）、末花期（S₃）3 个阶 段的花色进行了测定,开展了品种群间的花色关系及时空分布规律研究,旨在为挖掘和创制海棠特异种 质和花色育种提供参考。采用Origin7.0 软件构建了观赏海棠品种群花色在CIELCH 色空间中的三维动态 分布图,结果表明：在开花进程中,各品种花色在L*（亮度）、C*（饱和度）和h*（色调角）三个维度皆 呈规律性空间分布特点和阶段性变化趋势,所有品种的L*值持续上升而C*值持续下降,L *值高而C *值低 的品种权重显著增加;在h *维度方向,h * 值呈增大趋势,分布在红色区域（h *值0 ~ 20°）的品种权重由大 蕾期的85.6%下降至末花期的52.6%,而分布在黄色区域（h *值90° ~ 110°）的品种权重由大蕾期的2.1% 上升到末花期的28.9%。采用SAS6.12 软件构建了花色聚类分析树状图,结果表明：在遗传距离2.17 和 1.69 处,97 个海棠品种可以划分为3 大色系和6 个子色系类群,即紫红色系（含紫红、暗紫红和灰紫红 3 个子色系）、粉色系（粉红和白粉2 个子色系）和白色系类群,色系/子色系类群之间具有明显不同的色 彩参数特征。3 大色系品种花色淡化程度及淡化快慢节律差异显著,在大蕾期-盛开期-末花期的开花进 程中,白色系品种呈现由紫红-白（或稍带粉）-白色先快后慢的节律快速淡化为白色,粉色系品种由 紫红-粉-淡粉（或近白色）匀速淡化,紫红色系品种（A3 除外）呈现由紫红-紫红-淡紫红先慢后快 的节律淡化,总淡化程度显著低于粉花色系。在6 个子色系中,色彩稳定性最强的是暗紫红子色系（A2） 和紫红子色系（A1-1）,始终保持较高的饱和度,而粉花子色系色彩稳定性则逊色得多。     

月季（Rosa chinensis）丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析

 根据GenBank 发表的丁香酚合成酶（EGS）基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR 技术,从古老月季（Rosa chinensis）品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1 个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank 登录号为JQ522949。该基因全长为1 171 bp,开放阅读框（ORF）951bp,编码317 个氨基酸;蛋白质理论分子量为35.64 kD,等电点为7.36。氨基酸同源性分析表明,RcEGS1与矮牵牛PhIGS1 的氨基酸同源性达到70%,与罗勒ObEGS1 的同源性为59%,与月季RhEGS1 的同源性仅为48.2%。运用实时荧光定量PCR 法分析RcEGS1 在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达,发现其在叶片和茎段中没有表达,在花瓣和萼片中有表达,在盛开期的花瓣中表达量最高。     

滇牡丹类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定及表达分析

以野生黄花滇牡丹(Paeonia delavayi)为试材,采用RT-PCR技术,克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶(Pd5GT)基因,并对其进行生物信息学分析和转录模式分析,以期为研究滇牡丹花色素形成机理,滇牡丹糖基转移酶功能鉴定及花卉品质改良提供理论基础。结果表明:该基因全长1 410bp,编码469个氨基酸(GenBank登录号:ARA67364);生物信息学分析发现Pd5GT蛋白C末端含有PSPG盒子,其氨基酸序列为WCSQVEVLSHPSLGCFVTHCGWNSTTESLVCGVPVVAFPQWTDQGTNAKL,与已知功能的5GT蛋白序列聚为一类;该基因在茎、叶中微弱表达,在花中大量表达,在不同颜色的花瓣中均可大量表达。综上所述Pd5GT基因可能编码5-O-糖基转移酶,具有一定的组织特异性,花色特异性不明显。     

佛手和山金柑果形相关基因CRC的TRV-VIGS体系的构建研究

以芸香科的佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）和山金柑（Fortunella hindsii Swingle）花期叶片为材料,以果实发育相关的CRC基因为对象,利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）研究构建病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术体系,为基因功能研究提供有效简便的方法。待沉默的佛手植株剪枝、抹除花芽后,将CRC基因的沉默载体两次注射于佛手和山金柑的顶部叶片,注射间隔15～30 d。在注射后25～115 d内,佛手新生叶、新生花、果中的CmsCRC表达量均显著下调,且沉默植株的果形聚拢,果实指状结构数增加。CRC基因在佛手中的沉默有效时间是侵染后25～115 d,而在山金柑中沉默有效时间是25～105 d。     

草莓花色苷物质鉴定及关键基因表达分析

建立了应用HPLC–MS/MS快速分离、鉴定草莓花色苷的方法，并对不同果色12个草莓品种的成熟果实进行花色苷定量和定性分析，同时对比分析草莓（Fragaria×ananassa，八倍体）和森林草莓（F.vesca，二倍体）基因组中花色苷合成相关基因的数量和染色体定位，通过RNA-Seq和qRT-PCR分析它们在果实发育过程中的转录水平变化。在草莓中检测到8种花色苷，包括首次检测到的芍药素–3–葡萄糖苷、芍药素–丙二酰葡糖苷和芍药素–3–甲基丙二酰葡糖苷。不同果色草莓果实中总花色苷含量差异较大，均以天竺葵素–3–葡糖苷为主。草莓基因组包含73个花色苷合成相关基因，是森林草莓的3～4倍，均匀分布在4套亚基因组上。RNA-Seq结果显示整体上多拷贝基因在草莓果实中的表达水平没有显著差异，未发生明显的偏向性表达。花色苷合成关键路径基因（PAL1、CHS、CHI、F3H、DFR1、ANS、UFGT），转运基因（GST）和转录因子基因MYB10在草莓果实成熟过程中表达量显著增加，尤其是花色苷积累期，表明这些基因在草莓果实花色苷积累中起关键作用。     

七个江南牡丹品种花瓣中类黄酮物质分析

以“凤尾”、“凤丹白”、“西施”、“粉莲”、“昌红”、“呼红”和“云芳”7个江南牡丹品种为试材,利用UPLC-PDA和UPLC-Q-TOF MS技术对盛花期花瓣中类黄酮组分进行了定性和定量分析.结果表明:江南牡丹花瓣中共检测到15种类黄酮组分,其中花色苷4种:矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药花素-3,5-二葡萄糖苷、芍药花素-3-葡萄糖苷；黄酮7种:木犀草素单糖苷(六碳糖)、木犀草素二糖苷(甲基五碳糖+六碳糖)、芹黄素单糖苷(六碳糖)、芹黄素二糖苷(五碳糖+六碳糖)、芹黄素二糖苷(甲基五碳糖+六碳糖)、金圣草黄素单糖苷(六碳糖)、金圣草黄素二糖苷(六碳糖+甲基五碳糖)；黄酮醇4种:槲皮素单糖苷(六碳糖)、槲皮素二糖苷(六碳糖+六碳糖)、山奈酚二糖苷(六碳糖+六碳糖)、异鼠李素二糖苷(六碳糖+六碳糖)；江南牡丹花瓣中主要的花色苷为芍药花素-3,5-二葡萄糖苷和矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷,主要的黄酮为芹黄素糖苷,即芹黄素单糖苷(六碳糖)、芹黄素二糖苷(五碳糖+六碳糖)、芹黄素二糖苷(甲基五碳糖+六碳糖),黄酮醇为山奈酚糖苷,即山奈酚二糖苷(六碳糖+六碳糖).     

白菜病毒诱导基因沉默技术体系的建立

 以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种‘苏州青’为材料,利用芜菁黄化花叶病毒（Turnip yellow mosaic virus,TYMV）质粒pTY成功抑制了白菜叶片八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase,PDS）基因的表达,验证了病毒载体pTY在白菜上诱导基因沉默的能力,建立了白菜病毒诱导基因沉默VIGS体系。为了进一步验证病毒载体pTY在白菜上诱导基因沉默的能力,以BcNRT1为靶基因,构建pTY-BcNRT1质粒侵染白菜后,显著抑制了BcNRT1在转录水平的表达。     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

蜡梅的花色和色素组成及其在开花过程中的变化

以蜡梅的4个变种为材料,对其在开花过程中的花色、花色素组成及含量的变化进行研究。花色测定采用英国皇家园艺学会比色卡（RHSCC）和分光色差计,色素的定性及定量分析采用高效液相色谱 —二极管阵列检测技术（HPLC-PAD）和高效液相色谱—电喷雾离子化—质谱联用技术（HPLC-ESI-MS）。结果表明,在开花过程中,各蜡梅变种的花色呈明显变化。黄色外瓣和红色内瓣彩度C* 值均变小,黄色外瓣色相角h增大,由黄色向浅黄方向变化,而红色内瓣色相角h变小,由红色向深红方向变化。在蜡梅红色内瓣中检测到2种花青苷和3种黄酮醇,在黄色外瓣中检测到与红色内瓣相同的3种黄酮醇。其中花青苷为：矢车菊素 3-O-葡萄糖苷和矢车菊素 3-O-芸香糖苷;黄酮醇为：槲皮素 3-O-芸香糖苷、山奈酚 3-O-芸香糖苷和槲皮素苷元。首次检测出蜡梅花瓣中含有矢车菊素 3-O-芸香糖苷。蜡梅各变种间及每个变种的各开花阶段,色素种类没有差异,但色素含量发生了明显变化。从蕾期到初花期,黄色外瓣和红色内瓣的总黄酮醇（TF）含量迅速减少,花朵开放后变化平稳。红色内瓣的总花青苷（TA）含量在开花过程中较稳定。     

病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展

病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）是一种RNA 介导的植物抗病毒机制,近年来已被用作研究植物基因功能的反向遗传学手段。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,VIGS 技术研究周期短,不需要遗传转化,具有低成本、高通量等优势。因此,VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。综述了VIGS 的机制、技术发展、沉默效率的影响因素及其在植物基因功能鉴定中的应用,并对VIGS 在植物性状改良及植物保护方面的应用前景进行了展望。