芍药PlSVP基因的克隆及其花期调控功能分析

从芍药（Paeonia lactiflora）中克隆SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)基因,研究其对花期的调控功能,为芍药分子育种储备重要基因资源。采用RT-PCR方法从‘大富贵’芍药中克隆了PlSVP基因,其开放阅读框包含687bp碱基,编码228个氨基酸。系统进化树分析发现,PlSVP编码的蛋白与同属的牡丹PsSVP蛋白亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,PlSVP主要在营养器官中表达,在根中表达量最高,其次是叶片;在生殖器官花瓣中表达量极低。将PlSVP转化入哥伦比亚型野生型拟南芥,发现转PlSVP基因的株系较野生型的抽薹、开花时间分别延迟7和15d;在拟南芥svp-41突变体中过表达PlSVP发现,其不再呈现早抽薹、早开花表型,即PlSVP基因回补了svp-41突变体的功能缺失。进一步比较研究表明,拟南芥转PlSVP基因植株中FT、SOC1、LFY、AP1等SVP下游开花促进基因的表达量均显著下调。以上结果表明,芍药PlSVP基因负调控植物开花时间,并且可能通过抑制FT、SOC1、LFY、AP1等基因表达而发挥其负调控功能。     

马缨杜鹃查尔酮异构酶基因RdCHI1的克隆与功能解析

为了研究马缨杜鹃（Rhododendrondelavayi）查尔酮异构酶（CHI）的功能,以其花朵为材料,克隆获得了1个Rd CHI1基因。通过多序列比对、系统进化分析、q RT-PCR、拟南芥的遗传转化和抗逆试验,探究Rd CHI1参与花色苷合成与抗逆的作用。结果表明,Rd CHI1的CDS序列长663 bp,编码220个氨基酸,预测其蛋白分子量为23.728k D。多序列比对分析显示,Rd CHI1与拟南芥、苜蓿CHI的相似性分别为56.52%和56.07%。开花过程中Rd CHI1的表达水平先上升后下降,在雌蕊中表达量最高,花瓣和根中相对较低。拟南芥转化试验表明,Rd CHI1可以恢复CHI突变体（tt5）缺失的花色苷与黄酮醇,使其幼苗子叶与下胚轴颜色由绿色恢复为紫色。逆境表明,Rd CHI1过表达拟南芥植株在氯化钠和甘露醇胁迫下比野生型具有更好的适应力与存活率,证明Rd CHI1在植物中具有抵抗逆境的潜在作用。     

龙眼ELF4同源基因的克隆与功能研究

以‘红核子’龙眼（Dimocarpus longan）叶芽为材料,克隆了ELF4同源基因DlELF4-1和DlELF4-2的cDNA全长序列,对序列进行了生物信息学分析,并通过转化拟南芥以及实时荧光定量PCR研究基因功能。蛋白序列比对结果表明,DlELF4-2与AtELF4-L1有较高相似度,而DlELF4-1与AtELF4相似度更高;构建两个基因的植物表达载体转化拟南芥,转基因植株都表现出延迟开花以及不定根生长的现象,表明DlELF4-1和DlELF4-2可能有抑制开花和促进生长素合成功能;DlELF4-1和DlELF4-2在龙眼花芽分化过程的表达模式不同,推测其在龙眼花芽分化过程中有不同的功能。     

茄子紫外光受体蛋白基因SmUVR8的克隆及功能分析

以光敏感型茄子(Solanum melongena L.)‘蓝山禾线茄’子叶为材料,克隆了紫外光受体蛋白基因UVR8同源基因SmUVR8的cDNA全长序列,并对序列进行生物信息分析,通过转化拟南芥突变体以及实时荧光定量PCR研究其功能。序列分析表明,SmUVR8的CDS全长1 530 bp,编码509个氨基酸,属于较不稳定亲水性蛋白。蛋白序列比对发现,SmUVR8与其他茄科植物的UVR8高度同源。通过拟南芥uvr8突变体转化试验发现,转基因植株(SmUVR8/uvr8)恢复了野生型的表型,说明SmUVR8与拟南芥的UVR8功能具有相似性。通过实时定量PCR发现,UV-B照射影响SmUVR8以及下游SmHY5和SmCHS的表达。酵母双杂交结果表明,SmUVR8与SmCOP1的互作依赖于UV-B。推测UV-B在茄子中是通过紫外光受体SmUVR8与SmCOP1的互作,促进SmHY5和SmCHS的表达。     

黄瓜bZIP基因家族鉴定及功能分析

为研究bZIP家族基因在黄瓜表皮毛发育过程中的功能,利用生物信息学方法对黄瓜bZIP家族基因进行全基因组鉴定、染色体定位、系统进化分析、基序分析和结构域预测,并结合转录组分析和拟南芥异源转化,筛选与黄瓜表皮毛发育相关的基因。结果表明,黄瓜全基因组编码75个bZIP家族成员,不均等地分布在黄瓜的7条染色体上。该家族成员分为10个亚家族,各亚族成员具有相似的基因结构和保守基序。其中,对4个差异表达的bZIP基因CsaV3＿7G003290、CsaV3＿4G004890、CsaV3＿2G031960和CsaV3＿3G046530的拟南芥同源基因突变体表型观察发现,Atbzip47和Atbzip56拟南芥突变体茎秆处表皮毛数量显著减少。将CsaV3＿2G031960和CsaV3＿3G046530基因在Atbzip56突变体中进行异源转化,回补了Atbzip56突变体的表型。此结果为进一步解析CsbZIPs基因成员在黄瓜表皮毛发育中的功能和调控路径提供了参考。     

荔枝GA信号途径基因LcPIF4的克隆及其功能分析

【目的】克隆荔枝GA信号途径的LcPIF4基因,并对其序列特征、表达特点、基因功能、亚细胞定位及互作蛋白进行研究。【方法】利用花穗RNA-seq数据对LcPIF4基因进行生物信息预测及分析,通过qRT-PCR对LcPIF4基因在不同组织的表达进行研究,并在表达水平上分析其对烯效唑的响应。通过拟南芥转基因株系的构建对其基因功能及亚细胞定位进行分析,同时利用酵母双杂分析其与Lc DELLA-1蛋白的互作。【结果】克隆的荔枝LcPIF4基因ORF长1 617 bp,编码539个氨基酸,且具有经典的APB结构域和HLH结构域。qRT-PCR结果表明,LcPIF4基因在花穗、叶片、果皮等器官表达水平较高,且烯效唑处理后其表达水平显著下降。转基因试验表明,在拟南芥中过表达LcPIF4基因可促进下胚轴生长,且过表达LcPIF4-YFP的转基因材料可在细胞核位置检测到荧光信号。酵母双杂交结果表明,LcPIF4与赤霉素途径阻遏蛋白LcDELLA-1存在直接的蛋白互作。【结论】荔枝LcPIF4蛋白具有拟南芥PIF4蛋白相同的结构域;LcPIF4在花穗中高表达,且其表达被烯效唑所抑制。LcPIF4可促进拟南芥下胚轴生长,其编码蛋白定位于细胞核。LcPIF4蛋白与Lc DELLA-1在酵母中存在互作。     

龙眼TFL1同源基因在拟南芥和烟草中过量表达的功能研究

为了研究龙眼TFL1同源基因Dl TFL1-1和Dl TFL1-2的功能,构建植物表达载体p CAMBIA2300-DlTFL1-1和p CAMBIA2300-DlTFL1-2,利用根癌农杆菌GV3101介导将DlTFL1-1和Dl TFL1-2分别转化拟南芥和烟草,观察基因过量表达对拟南芥和烟草开花时间和表型的影响。DlTFL1-1和DlTFL1-2蛋白与AtTFL1有高度相似的二级结构,并具有典型的PEBP保守结构域,但是在蛋白质三级结构上明显不同。在长日照和短日照条件下,DlTFL1-1和DlTFL1-2转基因拟南芥都出现了开花延迟的现象,长日照下比野生型对照分别延迟了10.0和6.8 d,短日照下分别延迟了5.3和3.0 d;转基因拟南芥花序分支明显增多。Dl TFL1-1和Dl TFL1-2转基因烟草也出现了开花延迟的现象。q PCR结果显示长日照下Dl TFL1-1和DlTFL1-2转基因拟南芥叶片中AtFT的表达量显著下调,花序中AtLEAFY和AtAP1的表达量显著下调。试验结果表明DlTFL1-1和DlTFL1-2具有抑制花芽分化的功能,可能是龙眼中的开花抑制基因。     

芥菜开花相关基因AGL24的表达及与SOC1、SVP和FLC蛋白的互作

为阐明芥菜（Brassica juncea Coss.）开花激活因子AGL24的表达特性及其在开花途径中与调节因子SOC1、SVP和FLC蛋白的互作机制,从‘青叶芥’中克隆了680 bp的AGL24基因,它编码221个氨基酸。序列分析表明：芥菜AGL24含有M、I、K和C域,分别有59、11、102和47个氨基酸,与油菜AGL24亲缘关系较近。荧光定量PCR分析发现：在低温春化途径和长日照光周期途径中,AGL24在叶片和茎尖中均有表达,营养生长期表达量较低,而生殖生长期表达量迅速增加;AGL24在光周期途径中的表达峰值要早于低温春化途径。酵母双杂交试验表明：全长AGL24与开花信号整合子SOC1蛋白能够互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/AbA平板培养基上长出蓝斑。另外,分别去掉M域后的截短体AGL24与SOC1也能相互作用。β–半乳糖苷酶活性检测发现：截短体杂交组合AGL24 × SOC1的互作强度显著高于全长杂交组合AGL24 × SOC1。然而全长AGL24或截短体AGL24 均不能与光周期途径核心抑制子SVP互作,也不与低温春化途径核心抑制因子FLC相互作用,说明AGL24并不是SVP或FLC的直接靶蛋白。     

牡丹开花调控转录因子基因PsCOL4的克隆、表达与系统进化分析

采用RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到1个重要开花调控转录因子基因CONSTANS-like,其cDNA 全长1 125 bp,编码373 个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含两个B-box 型锌指结构和1 个CCT 结构域,与拟南芥的AtCOL4 最为相似,将其命名为PsCOL4,GenBank 登录号为KF113358。系统进化树分析表明,PsCOL4 与葡萄编码的VvCOL4的亲缘关系最近,属于第1 群组CO 类似基因。实时定量PCR 表明,PsCOL4 在不同组织器官中均有表达,其中茎和叶中的表达量最高,根中最低。在花芽不同发育时期,PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同光周期条件下,PsCOL4 的表达稍有不同,短日照条件下在叶中的表达有所增加,茎中稍有减少。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

洋葱开花相关基因AcLFY 的克隆与表达分析

 以洋葱（Allium cepa L.）品系‘1007’为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR 的方法, 获得植物开花调控关键基因LEAFY 的同源基因的cDNA 序列,命名为AcLFY,GenBank 登录号为 JX275962。序列分析表明,该基因包含1 个1 119 bp 的开放阅读框,编码372 个氨基酸,该氨基酸序列 含有5′-N 端脯氨酸富集区,亮氨酸拉链结构和中央酸性区,具有LEAFY（FLO）家族的典型结构特征。 同源分析表明,该氨基酸序列与水仙的同源性接近70%,与其他高等植物LEAFY 类蛋白的同源性均在 50%以上。进化树分析表明AcLFY 与单子叶植物的亲缘关系高于双子叶植物。荧光定量结果显示,AcLFY 在洋葱抽薹开花的整个过程中都有表达,在抽薹初期的花序分生组织中表达量最高,在花器官中只有微 量表达,花器官形成后,主要在叶片中表达。     

桃乙烯应答因子PpERF1a的克隆与功能分析

以‘丰光’油桃嫩梢组织为试材,克隆了1个ERF家族基因并命名为PpERF1a（ppa018178m）。该基因全长为600 bp,编码199个氨基酸,含有1 个典型的AP2 结构域。亚细胞定位结果显示PpERF1a定位于细胞膜和细胞核。在拟南芥中超量表达PpERF1a,共获得15个阳性转基因株系。与对照相比,转基因植株出现发育不良的表型,其中6株持续长出莲座叶,但不抽薹;6株能够抽薹开花,但不结实且生长势明显弱于对照;3株能够开花结实,但种子产量极低。这些结果表明PpERF1a在转基因拟南芥中具有调控生长发育的功能,为后期在桃中开展PpERF1a的功能研究提供了有益的启示。     

桃ABA 8’–羟化酶基因PpeCYP707As在拟南芥中过表达的功能分析

以8年生‘中油4号’油桃为试材,对休眠期的枝条进行ABA和GA处理发现,ABA延迟芽体萌动,GA促进萌芽和提前开花,在桃芽萌发中ABA和GA起拮抗作用。利用转基因技术在拟南芥中过表达桃ABA分解代谢关键酶ABA 8’–羟化酶基因PpeCYP707A1、PpeCYP707A2和PpeCYP707A3,获得纯合株系,RT-PCR结果表明,目的基因在过表达株系中的表达量分别达到对照的23.86倍、7.37倍、3.23倍;过表达株系生长缓慢,抽薹、开花延迟,其中过表达PPECYP707A1株系生长最慢,开花最晚;过表达株系种子萌发和幼苗生长对ABA不敏感,受伤害程度小;10℃低温处理试验证明,过表达株系相对生长速率高于野生型,推测低温条件下,过表达CYP707As正调控拟南芥的生长发育。     

抽薹开花抑制因子FLC 表观遗传调控研究进展

FLOWERING LOCUS C（FLC）是植物抽薹开花调控网络中关键的开花决定因子。随着表观遗传学的发展，人们发现组蛋白修饰等表观调控FLC 的表达在植物抽薹开花时间调控中起着非常重要的作用。FLC 的抑制因子或促进因子通过改变组蛋白氨基酸的共价修饰（如乙酰化、甲基化等），影响FLC基因所在区域的染色质重塑，调控FLC 转录表达水平，从而调节植物抽薹开花。本文就近年来国内外对植物抽薹开花关键调控基因FLC 及表观遗传调控其表达研究现状进行了综述，并针对目前研究中存在的问题提出了今后的研究方向和重点。     

抽薹开花调控基因SVP 的作用机制

SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）基因属于MADS 盒基因,它编码的蛋白转录因子对开
花具有抑制作用。SVP 主要在营养生长阶段表达,受自主途径等多个开花路径调控,并可以调节开花途径
整合子FLOWERING LOCUS T（FT）,SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）
的表达,从而调控抽薹开花时间。本文综述了SVP 基因调控抽薹开花的作用机制,并结合SVP 基因的研
究现状展望了未来的研究方向。     

牡丹隐花色素基因PsCRY2的克隆与表达分析

以‘秋发1号'和‘洛阳红'牡丹(Paeonia suffruticosa)为试验材料,采用RT-PCR的方法从花芽中克隆得到1个隐花色素基因Cryptochrome 2,其ORF全长为1902 bp,编码633个氨基酸,基因登录号为KP982893。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含1个PHR和1个CCT结构域,与拟南芥中AtCRY2最为相似,将其命名为PsCRY2。系统进化树分析表明,PsCRY2与甜橙(Citrus sinensis)CsCRY2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,PsCRY2在牡丹的不同组织器官中均有表达。其中,成年植株的花芽以及种子胚的表达量最高,幼苗根、茎、叶次之。在整个花芽分化不同时期,PsCRY2的表达呈现较高的表达水平;在花蕾发育不同时期,PsCRY2的表达呈现先降低再升高而后有降低的趋势,大风铃期表达量最高,推测PsCRY2在花芽分化和花蕾发育的过程中均起到重要作用。在‘洛阳红'和‘秋发1号'牡丹春季花芽发育过程中,PsCRY2的表达均呈升高的趋势,‘秋发1号'显著高于‘洛阳红'。不同光周期条件下,PsCRY2表达稍有不同。与长日照条件相比,短日照条件下PsCRY2在现蕾期和小风铃期的表达量均下降。     

胡萝卜FLC 同源基因对低温及光周期响应

 基于‘松滋野生’（Ws）和‘Amsterdam’（Af）胡萝卜转录组测序，挖掘胡萝卜FLC 同源 基因（DcFLCs），深入研究其对低温及光周期响应规律。结果表明，胡萝卜中存在3 个具有完整MADS-box 和K-box 保守结构域的FLC 同源基因DcFLC1、DcFLC2、DcFLC3，分别编码209、212、219 个氨基酸 残基蛋白，进化树显示与其它植物FLC 亲缘关系较远。RT-PCR 表明DcFLC1 和DcFLC2 在供试材料中均 表达，而DcFLC3 仅在部分材料中表达。qPCR 结果显示低温能促进DcFLC1 和DcFLC3 在耐抽薹品种 Af 幼苗叶片和种根中表达，而DcFLC2 仅在Af 种根中表达显著，在幼苗叶片中表达不显著。DcFLC1 和 DcFLC2 在抽薹敏感的Ws 幼苗叶片和种根春化过程中表达规律不同，低温能促进DcFLC1 在幼苗叶片以 及DcFLC2 在种根中表达。连续光照能促进DcFLC1、DcFLC2 在Af 幼苗叶片中表达，但在Ws 中则不同。