龙眼miR397家族成员分子特性及其在体胚发生早期的表达分析

【目的】探讨龙眼miR397家族成员的分子特性及其在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织为材料,通过对龙眼miR397前体序列二级结构分析、进化树构建、靶基因预测与裂解位点验证、以及龙眼miR397a在龙眼体胚发育早期和不同激素浓度处理下的表达规律进行分析。【结果】龙眼miR397前体序列5端臂上可生成两个序列高度重合的成熟体序列dlo-miR397a和dlo-miR397,二者仅有5端两个碱基TC之间的差异,前体能形成稳定的茎环结构;进化树分析发现龙眼miR397前体与桃、可可、脐橙等亲缘关系较近,处于同一分支,龙眼miR397与拟南芥、甜橙、葡萄等亲缘关系较近,处于较为保守的同一分支,miR397家族成员较前体序列在进化上更为保守。靶基因预测表明龙眼miR397家族主要靶向调控漆酶基因家族和一条姐妹染色单体粘连蛋白(dlo_039206.1)。裂解位点验证发现靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的裂解位点,但位于预测区间外。miR397a在体胚发生过程中对于靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的调控模式在0～3 d较为一致,均为下调表达,6～12 d为显著上调表达,且二者呈典型的负调控关系。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,而靶基因姐妹染色单体粘连蛋白则在激素处理下的表达趋势并不明显,可能由于靶向裂解位点在预测区外所致。【结论】龙眼miR397a可能在龙眼体胚发生早期的6～12 d,通过靶向调控姐妹染色单体粘连蛋白影响龙眼体胚发生早期形态建成。龙眼miR397家族在进化上较为保守,其靶基因主要靶向调控龙眼漆酶家族和姐妹染色单体粘连蛋白。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,表明其在龙眼体胚发生早期可能通过激素信号传导参与龙眼体胚发生早期形态建成。     

番茄LemiR390及其预测靶基因LeTAS3的鉴定与表达分析

以番茄（Lycopersicon esculentum）紫色花青素积累品系Aft基因型‘LA1996’为试验材料,以番茄总RNA反转录的cDNA文库为模板,根据mirbase数据库中MIR390基因和番茄unigene数据库预测到的靶基因序列,克隆番茄LemiR390前体基因及其预测靶基因LeTAS3;采用定量PCR技术检测LemiR390及其预测靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育阶段的表达情况,利用RLM 5′RACE技术验证LemiR390对靶基因mRNA的剪切作用。结果表明,克隆到两个LemiR390的前体,分别与MIR390a和MIR390b一致,含有完整的茎环结构。LemiR390与其靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育时期表达量不同,果实发育前期特别是花后1 ~ 2周幼果期表达量高,发育后期均下降为微量表达,并且在幼果期LemiR390与LeTAS3表达呈负调控关系。LemiR390能够靶作用于LeTAS3的转录本调控其降解,其剪切位点为LemiR390序列5′端的第10位碱基。     

香蕉漆酶基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能,采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员,分析其低温胁迫下的表达情况,为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A（Musa acuminata）基因组筛选了22条漆酶基因（MaLAC）,从香蕉B（Musa balbisiana）基因组筛选了11条漆酶基因（MbLAC）,通过生物信息分析发现MaLAC比MbLAC更保守。分子进化树分析结果表明MaLAC可分为5类,MbLAC可分为4类。启动子顺式作用元件分析结果表明,MaLAC启动子序列包含大量光响应、激素应答及非生物胁迫等应激响应元件,推测MaLAC基因家族在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。利用qRT-PCR技术对MaLAC部分成员在响应不同低温胁迫的表达情况进行分析,MaLAC3-2、MaLAC4、MaLAC4-5、MaLAC17在低温（13、4、0 ℃）处理下表达量均极显著高于对照（28 ℃）,推测可能在香蕉响应低温胁迫的过程中发挥重要作用。预测香蕉MaLAC家族有18个成员受miRNA调控,主要受miR397和miR408的调控;推测香蕉MaLAC可能参与miRNA调控途径。     

番茄漆酶基因LeLACmiR397的克隆与表达分析

通过BLAST分析,获得了番茄漆酶（Laccase,LAC）基因相关的15个EST片段,并对这些EST进行了同源比较和序列拼接,得到1个含有小分子RNA miR397识别位点的LAC片段,命名为LeLACmiR397。根据蛋白质结构域推测,LeLACmiR397蛋白存在1个Cu–氧化酶结构域。LeLACmiR397时空表达分析表明,其在番茄根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达,而在叶中不表达。根据该片段的核苷酸序列信息进行5′-和3′-RACE扩增,得到了番茄LAC基因的全长cDNA（LeLACmiR397,登录号EU503151）,其在番茄基因组中对应的基因为Solyc07g049460.2.1。通过在番茄中过表达miR397a基因,发现转基因番茄中LeLACmiR397表达量降低,同时其PPO、POD、SOD含量也有所下降。用丁香酸和芥子酸处理转基因植株幼苗,其根系比非转基因植株更长,抗性增强,表明LeLACmiR397与番茄植株的抗性反应有关。     

桃漆酶家族基因鉴定及PpLAC21功能分析

利用生物信息技术鉴定了桃中漆酶（LAC）家族成员,分析其进化关系分析、基因结构、启动子区顺式作用元件以及表达模式。结果表明,在桃基因组中共鉴定出48个漆酶基因,通过在桃子叶愈伤组织中的表达模式分析,发现1个表达量很高的关键成员PpLAC21,在该基因沉默的桃愈伤组织中,木质素的含量下降,推测该基因可能参与桃愈伤组织的木质素合成。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

桃果实中miR160a与其靶基因ARF的鉴定及对IAA的响应分析

以水蜜桃品种‘小白凤’果实为试材,利用miR-RACE技术验证了桃mi R160a的精确序列,克隆了其3个ARF靶基因(PpARF18、PpARF17和PpARF18-like)的ORF序列。利用RLM-RACE技术以及qRT-PCR方法对Ppe-miR160a作用于3个靶基因的模式及频度进行了分析。结果表明,Ppe-miR160a的精确序列与预测序列在5′端和3′端均存在1个碱基的差异,其3个靶基因ARF均含有高度保守的B3和生长素响应DNA结合域。RLM-5′RACE结果显示,Ppe-miR160a以裂解的方式作用于3个ARF靶基因,且裂解位点均位于Ppe-miR160a5′端的第9和第10位碱基之间。IAA响应分析表明,与对照相比,IAA处理后的桃果实中Ppe-miR160a以及3个靶基因3′端裂解产物的表达量均显著升高。以上结果表明桃果实中的Ppe-miR160a通过介导其3个靶基因的裂解参与生长素信号途径调控。     

葡萄SPL9和SPL10基因全长cDNA克隆、亚细胞定位和表达分析

 从‘夏黑’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca ‘Summer Black’）中克隆了SBP（Squamosa promoter binding protein）类重要转录因子基因SPL9和SPL10全长cDNA序列,在GenBank的登录号分别是HM018600和HM018601,序列分析表明二者均具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）、SBP结构域以及葡萄microRNA156a（Vv-miR156a）的靶序列。进一步构建Vv-SPL9和Vv-SPL10亚细胞定位表达载体,对其是否具有核定位功能进行了研究,并利用半定量、荧光定量RT-PCR研究了这两个基因与Vv-miR156a在葡萄不同组织的表达情况。结果表明：转录因子SPL9和SPL10均定位于细胞核中,而且两个基因在葡萄各个组织中均有表达,但表达量存在差异,两者均在小果中的表达量最高。Vv-miR156a的积累水平与这两个基因在各个组织中的表达呈现一定的消长关系,并且在小果中最为明显。     

香蕉漆酶基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能,采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员,分析其低温胁迫下的表达情况,为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A(Musa acuminata)基因组筛选了22条漆酶基因(MaLAC),从香蕉B(Musa balbisiana)基因组筛选了11条漆酶基因(MbLAC),通过生物信息分析发现MaLAC比MbLAC更保守。分子进化树分析结果表明MaLAC可分为5类,MbLAC可分为4类。启动子顺式作用元件分析结果表明,MaLAC启动子序列包含大量光响应、激素应答及非生物胁迫等应激响应元件,推测MaLAC基因家族在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。利用qRT-PCR技术对MaLAC部分成员在响应不同低温胁迫的表达情况进行分析,MaLAC3-2、MaLAC4、MaLAC4-5、MaLAC17在低温(13、4、0℃)处理下表达量均极显著高于对照(28℃),推测可能在香蕉响应低温胁迫的过程中发挥重要作用。预测香蕉MaLAC家族有18个成员受miRNA调控,主要受miR397和miR408的调控;推测香蕉MaLAC可能参与miRNA调控途径。     

蓝莓不同硬度果实VcPLs基因克隆和功能研究

【目的】探究果胶裂解酶基因在蓝莓硬肉品种和软肉品种果实硬度差异中的作用,为选育高硬度蓝莓品种提供参考。【方法】以蓝莓硬肉品种Star和软肉品种O’Neal不同发育时期的果实为材料,测定果实硬度、细胞壁物质含量和果胶裂解酶活力,分析比较果肉细胞解剖结构,克隆果胶裂解酶基因并研究其表达模式,转化番茄验证VcPL的功能。【结果】S4（膨大期）到S6（红果期）时期是果实硬度快速下降关键时期,果肉细胞在发育初期细胞壁轮廓清晰,Star果肉细胞出现结构破损的时期晚于O’Neal,果实硬度与可溶性果胶含量、果胶裂解酶活力均呈极显著负相关,VcPL41和VcPL65编码区序列长度分别为1230 bp和1209 bp,Star和O’Neal中VcPL65氨基酸序列完全相同,VcPL41的序列在品种间有4个氨基酸差异。2个基因在Star中快速上调表达的时期晚于O’Neal。超表达VcPL41和VcPL65的番茄果实硬度显著小于对照组,可溶性果胶含量显著高于对照组。【结论】蓝莓硬肉品种Star和软肉品种O’Neal果实硬度差异受果胶裂解酶活力和可溶性果胶含量影响,VcPL41和VcPL65能够加速果实成熟软...     

葡萄果实β–葡萄糖苷酶基因克隆、原核表达及活性检测

 以‘玫瑰香’葡萄着色期的果肉为试材,通过反转录技术克隆了ABA合成相关酶β–葡萄糖苷酶基因VvBG1的1 518 bp编码区核苷酸序列,其编码1个含有505氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,VvBG1含有1个跨膜区和糖基水解酶1超家族保守域。通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶将除去信号的编码区克隆到原核表达载体pET28a（+）中,并转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,成功诱导并纯化了VvBG1融合蛋白。经过透析复性和超滤浓缩得到了0.8 mg · mL^-1可溶的融合蛋白。通过纯化蛋白葡萄果肉均浆液孵育试验和GC–MS ABA含量分析证实了葡萄果实中β–葡萄糖苷酶VvBG1具有较高的生理活性。     

葡萄活性赤霉素合成关键基因VvGA3ox家族的克隆和表达分析

在植物赤霉素合成代谢中,GA3ox可将几种非活性赤霉素转化为具生理活性的赤霉素。以葡萄有核品种‘黑比诺’和无核品种‘无核白’为材料,克隆葡萄的VvGA3ox基因家族成员,分析基因结构、进行染色体定位和系统发育树构建,检测其组织器官表达特性和在胚珠（幼种子）发育过程的表达变化。结果表明,葡萄基因组VvGA3ox家族有3个成员,cDNA长度分别为1 313、1 225和1 480 bp,都包含2个外显子和1个内含子结构。组织器官特异性表达分析表明,VvGA3ox1在胚珠中的表达很低,在根中高表达;VvGA3ox2和VvGA3ox3在花和胚珠中的表达较高。在受精后胚珠（幼种子）发育过程中,VvGA3ox家族基因的表达趋势存在差异,其中VvGA3ox1在‘黑比诺’与‘无核白’中均是在盛花后30 d时上调之后下降;VvGA3ox2在‘黑比诺’中20 ~ 30 d极速上调之后下降,相应地‘无核白’中是先缓慢下降之后上升;VvGA3ox3在‘黑比诺’中逐渐下降,对应地‘无核白’中是在10 ~ 15 d先上升后在20 ~ 45 d呈下降趋势并逐渐与‘黑比诺’中的表达持平。VvGA3ox在有核和无核葡萄品种中表现较大差异表达,与葡萄无核性状有一定关系。     

铁皮石斛DoCDPK基因的克隆与表达分析

利用RACE技术和RT-PCR相结合,从铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）中克隆得到长度分别为1 863和1 729 bp的钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase）基因DoCDPK1与DoCDPK2的cDNA全长序列,开放阅读框分别为1 539和1 536 bp,编码512和511个氨基酸,编码蛋白表现为亲水性,结构稳定,二级结构主要由α–螺旋和无规卷曲构成。qRT-PCR分析结果表明DoCDPK1和DoCDPK2主要在铁皮石斛叶片中表达;4 ℃低温和400 mmol · L^-1 NaCl处理后,DoCDPK1和DoCDPK2在各个时间点上（2、4、8、12和24 h）的表达量有不同程度提高,而100 mmol · L^-1 ABA处理后DoCDPK1和DoCDPK2的表达量呈现不同变化趋势,推测DoCDPK1和DoCDPK2参与低温等非生物胁迫的响应。     

茉莉酸甲酯处理对葡萄果实NO 和H2O2 水平及植保素合成的影响

 以10 μmol · L-1 茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）熏蒸处理‘巨峰’葡萄果实6 h,随后转入1 ℃下贮藏28 d。结果表明,MeJA 处理显著抑制了葡萄果实在贮藏期间腐烂率和失重率的上升,促进内源NO 释放量和H2O2 含量在贮藏前期的上升,同时诱导植保素合成相关酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸–4–羟化酶（C4H）、对香豆酰–CoA 连接酶（4-CL）和白藜芦醇合成酶（RS）活性以及植保素白藜芦醇和白藜芦醇脱氢二聚体含量的上升。由此推测,MeJA 在葡萄果实细胞内发挥了信号传导作用,通过调控下游信号分子H2O2 和NO 的水平来提高植保素合成相关酶活性,从而促进了植保素的积累,提高果实的抗病性,降低了其腐烂率。     

桂花C4H基因的克隆与表达特性分析

利用转录组测序获得的表达序列信息,结合RACE技术,从桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第2步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。其ORF全长分别为1 518 bp和1 611 bp,各自编码505和536个氨基酸,命名为OfC4H1和OfC4H2（登录号分别为KR861466、KF254842）。系统进化树表明,OfC4H1与矮牵牛中的PhC4H1、PhC4H2等C4H蛋白聚为一类,属于Class Ⅰ类型;OfC4H2与金银花中的LjC4H等属于ClassⅡ类型。进一步的C4H蛋白序列多重比较发现,OfC4H1和OfC4H2蛋白具有该基因家族特有的保守结构域,在这些保守结构域中存在区别两类C4H蛋白的典型特征。利用Real-time PCR比较分析了OfC4H1和OfC4H2基因的时空表达模式,结果显示,OfC4H1在花瓣中的表达量最高;OfC4H2在花瓣中的表达量较低,在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建原核表达载体pET6xHN-C4Hs,转化Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明,目的蛋白能在原核表达系统中顺利表达,而且与预期大小一致,但因溶解度较低无法进行酶活性分析。     

葡萄果实中（–）–α–萜品醇的积累与其合成酶基因Vvter表达的关系

 以不同发育期的‘赤霞珠’和‘雷司令’葡萄果实为试材,应用气相色谱质谱联用技术和荧光实时定量PCR技术,研究了果实发育过程中游离态和糖苷态（–）–α–萜品醇含量与（–）–α–萜品醇合成酶[Vitis vinifera（-）-α-terpineol synthase]基因Vvter表达的关系。结果表明,糖苷态（–）–α–萜品醇在两个品种果实发育过程中均没有明显变化,游离态（–）–α–萜品醇在‘赤霞珠’中表现为随果实发育而降低,而在‘雷司令’中呈现先下降再上升后下降的趋势,同一品种中（–）–α–萜品醇总含量的变化与Vvter基因的表达成正相关。     

莲藕可溶性淀粉合成酶基因LrSSS的克隆与表达特性分析

以莲藕品种‘美人红’叶片为试材,利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长4 080 bp的莲藕可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS）cDNA序列（GenBank登录号：KP201636）,其中开放阅读框3 696 bp,编码1 231个氨基酸;该序列与甜瓜、葡萄SSS基因编码氨基酸序列同源性较高,分别达79%、69%。LrSSS 所编码的氨基酸序列包含3个典型的碳水化合物结合结构域（CBM_25）和1个淀粉合成酶催化域（Glyco_transf_5）。LrSSS 表达分析表明,莲藕根状茎膨大具3节段时,在终止叶叶片中的表达量最高,其次为后把叶叶片,终止叶叶柄表达量最少;在根状茎膨大至4节段时,LrSSS在第1、2节段根状茎中表达量较高,在第3、4节段根状茎中表达量较低,表明在第1、2节段根状茎形态基本建成后LrSSS在调控产物转化为淀粉过程中可能起到重要作用。     

‘香妃’和‘早玫瑰香’葡萄温室与露地栽培单萜积累差异分析

温室栽培对鲜食葡萄果实单萜积累的影响尚不明确。以早熟鲜食葡萄品种‘香妃’和‘早玫瑰香’为试材进行温室栽培,以露地栽培作为对照。采用顶空固相微萃取(HS–SPME)结合气相色谱—质谱联用(GC–MS)技术,辅助自动质谱图解卷积和鉴定系统(AMDIS),检测葡萄果实中游离态单萜类化合物的含量。共检测到29种来源于异戊二烯代谢途径的单萜类化合物。两个葡萄品种单萜类化合物总含量随果实发育均呈升高趋势,且露地栽培均高于温室栽培,果实成熟期‘香妃’高于‘早玫瑰香’。利用主成分分析(PCA)可以明显区分开温室和露地栽培下的‘早玫瑰香’,但两种栽培条件下‘香妃’的单萜化合物在成熟期愈加接近;整体趋势表现为露地栽培葡萄果实具有更丰富的柠檬烯、(Z)–别罗勒烯、(E,Z)–别罗勒烯、里那醇、β–月桂烯、异松油烯、(Z)–β–罗勒烯、cis和trans–氧化玫瑰、β–香茅醇和cis–吡喃型氧化里那醇。     

根域限制对‘巨玫瑰’葡萄果实可溶性糖含量及相关代谢酶活性的影响

 以‘巨玫瑰’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.）为试材,从始熟期开始研究了根域限制栽培对果实可溶性糖积累及相关代谢酶活性的影响。结果表明：‘巨玫瑰’葡萄果实中主要以葡萄糖和果糖积累为主。从始熟期开始果实中的葡萄糖和果糖含量持续增加,与此同时,酸性转化酶（AI）的活性也随果实发育进程而逐步增强。AI活性与果实中含量最多的葡萄糖和果糖含量显著相关。中性转化酶（NI）和蔗糖合成酶（SS）的分解方向的活性只是在始熟期3周后开始增加,且活性低于AI。蔗糖合成酶（SS）的合成方向和蔗糖磷酸合成酶（SPS）的活性在始熟期开始后稍有增加,此后保持平稳,且活性远远低于蔗糖分解相关酶AI、NI和SS的分解方向活性。根域限制栽培可以显著提高‘巨玫瑰’果实中可溶性糖的含量、糖积累期间的AI活性和成熟时的NI活性,但对其他酶活性影响不显著。由此推断AI是葡萄果实糖积累的最重要的调节因子,也是根域限制提高果实糖含量的关键代谢酶。