RNA干扰技术抑制新家坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达

新加坡石斑鱼虹彩病毒（singapore grouper iridovirus,SGIV）是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46（infected cell polypeptides 46）基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞（fathead minnow cells,FHM）中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV-ICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV-ICP46的siRNA（siRNA-ICP46）,与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24~48 h,实验细胞（共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46）和阳性对照细胞（共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46）中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照（共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46）少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72 h其与阴性对照组已差别不大。说明体外化学合成的siRNA-ICP46转染后24~48 h可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV-ICP46基因的表达。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒 ICP46核输出信号序列的定位与功能鉴定

新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒, 可导致石斑鱼死亡率达90%以上, 给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因, 可能参与细胞的生长调控, 并对病毒复制有重要作用。在SGIV ICP46序列中存在一段富含亮氨酸(Leucine, L)的潜在核输出信号(nuclear export signal, NES)。为了深入研究该段NES序列在SGIV ICP46核转运过程中的作用, 实验构建了3个NES缺失的突变体: 仅含NES之前片段的突变体(ΔNESa)、仅含NES之后片段的突变体(ΔNESb)和不含NES的全长片段(ΔNESc), 并在真核细胞中表达, 观察这些突变体在细胞内的定位情况。转染细胞实验结果表明, 野生型EGFP-ICP46重组蛋白可以有效地被输出细胞核, 荧光信号主要分布在胞质区; 相反, NES缺失的EGFP-ICP46-ΔNES重组蛋白不能被有效地输出细胞核, 呈现与EGFP对照相同的泛细胞分布特征。突变实验证明, NES对SGIV ICP46输出细胞核具有决定性作用。     

鞍带石斑鱼isg15基因cDNA克隆及其在虹彩病毒感染下的表达分析

本研究利用PCR和RACE技术首次获得了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)干扰素刺激基因15(interferon stimulated gene 15,isg15)全长序列.isg15基因序列长为910 bp,包含一个468 bp的开放阅读框,可编码155个氨基酸,预测分子量为17.09 k...     

绿色荧光蛋白基因重组子的构建及其在鱼类受精卵中的表达

通过体外重组，将绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到鲤鱼肌动蛋白基因启动子下游，构建成能在鱼体内表达绿色荧光蛋白的重组分子。用限制性内切酶PvuI酶切线性化后，通过显微注射法导入金鱼受精卵内，在转化后48h，可观察到绿色荧光，经PCR初步筛选后，对显阳性个体进行Southern杂交检测，结果表明，转化个体表现出较强的杂交信号。这说明绿色荧光蛋白基因能在金鱼体内整合、表达。     

斑马鱼Mylz2启动子的克隆与转绿色荧光蛋白基因鱼的构建

为获得能在肌肉表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼(Brachydaniorerio),采用PCR方法,从斑马鱼基因组DNA中分离了肌球蛋白轻链2启动子,序列分析表明,该启动子与国外文献报道的斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子序列的相似性为98.6%。将改造后的启动子插入绿色荧光蛋白基因载体,构建成肌肉特异性表达载体。通过显微注射,将线性化的表达载体注入斑马鱼的受精卵,获得了转绿色荧光蛋白基因的斑马鱼。绿色荧光蛋白在胚胎期开始表达,随着鱼体的生长表达量有增加的趋势,成鱼在紫外灯下用肉眼即可观察到绿色荧光。转基因鱼绿色荧光蛋白的表达具有明显的肌肉特异性。本研究为下一步特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。     

谷氨酰胺对斜带石斑鱼GF-1细胞中C-Myc蛋白的表达与神经坏死病毒复制的影响

为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)为285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。实验表达和纯化了GF-1-C-Myc蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术(qRT-PCR)与免疫印迹法(WB)检测了GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒(NNV)的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc基因的表达,并显著消耗GF-1细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控NNV的感染提供了参考。     

克氏原螯虾细胞色素c基因通过调节凋亡途径抑制WSSV感染

细胞凋亡是由一系列相关基因严格调控的细胞程序性死亡,在抵御病原入侵、维持机体内环境稳态等方面有着重要意义。其中细胞色素c从线粒体释放到细胞质中是凋亡开始的关键一步。本研究利用RACE技术首次克隆获得了克氏原螯虾(Procambarus clarkii)细胞色素c基因(PcCytc),全长为897 bp,包括163 bp的5′-UTR、419 bp的3′-UTR和315 bp的开放阅读框,编码104个氨基酸。定量PCR检测结果显示,PcCytc基因在克氏原螯虾的各组织中均有表达,其中在鳃、肠道和肌肉中表达高,在胃中表达最低。WSSV感染实验显示,在病毒感染后PcCytc在肝胰腺、肠道和肌肉组织中的表达水平均出现上调,并在24 h达最高值,约是此时PBS组表达量的2.65、2.07和2.20倍,均存在极显著性差异(P<0.01)。PcCytc基因干扰后,克氏原螯虾体内WSSV病毒拷贝数显著增加(P<0.05),表明PcCytc能够抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制,延迟感染;同时,凋亡相关基因bcl-2、bax和caspase-3的表达均发生显著上调或下调(P<0.05)。本研究表明,PcCytc可通过调节凋亡途径抑制WSSV感染,为克氏原螯虾对WSSV感染的免疫反应提供了新的见解。     

拟态弧菌的绿色荧光蛋白标记及其在感染草鱼体内的动态分布

为了示踪研究拟态弧菌感染草鱼的动态过程,将增强型绿色荧光蛋白编码基因EGFP克隆至质粒pBAD24,并转化到拟态弧菌04-14菌株构建荧光标记重组菌.重组菌经阿拉伯糖诱导后,能高效表达EGFP蛋白;荧光显微镜观察和流式细胞仪检测均发现重组菌能够发出明显的绿色荧光信号,且传至30代后质粒稳定率仍为100％;生物学特性检测结果显示,与野生株相比,重组菌的形态、生长特性和细胞黏附性均未发生明显改变.用标记重组菌浸泡感染草鱼,定点采集鳃、肠道、肌肉、头肾、脾脏和肝脏,借助荧光信号检测4d内细菌在不同组织脏器中的动态分布.结果发现感染4h后即可在肠道和鳃中检测到绿色荧光信号,标记菌检出量分别为3.60×108和2.36×106 CFU/g,直至10 h,其含量无明显变化,12 h后含菌量逐渐下降,但持续存在直至鱼死亡.标记菌在肌肉、头肾、脾脏和肝脏中呈现相似的动力学,感染24 h后才检测到荧光信号,24～ 85 h时间段含菌量呈现先增加后下降的变化,48 h达到峰值,检出量分别为9.58×104(肌肉)、8.75×104(头肾)、1.50×104(脾脏)和4.50×104 CFU/g(肝脏),但均低于肠道中的检出量,结果表明肠道是拟态弧菌黏附定植与繁殖的主要靶器官.     

石斑鱼虹彩病毒ORF050的分子特征和功能初步分析

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖产业严重经济损失的主要病毒病原之一。SGIV 是大分子DNA病毒,包含162个基因开放阅读框,其中ORF050是一个肿瘤坏死因子受体类似物,可能在SGIV的免疫逃避中发挥作用。本研究克隆了SGIV ORF050基因,并构建了全长基因的真核表达重组质粒和四个半胱氨酸富集结构域(CRD)分别缺失的突变体。RT-PCR和药物抑制实验结果表明,SGIV ORF050是病毒的一个立即早期基因。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞质内均匀地弥散性分布,并在细胞核周围聚集;第一个CRD缺失后,基因的定位发生明显的变化,即呈点状分布在胞质中,推测第一个CRD对其功能有影响。在过表达SGIV ORF050的鱼类细胞中观察SGIV感染引起的CPE,发现与对照相比没有明显区别;荧光定量PCR检测SGIV 主要衣壳蛋白MCP的转录表达水平,也没有明显变化,提示该基因对SGIV在宿主细胞内的复制增殖可能没有影响。荧光定量PCR检测过表达ORF050的细胞在SGIV感染后宿主TNF/TNFR的转录水平,结果显示在感染10 h后TNF1、TNF2和TNFR2的表达量升高了2～3倍,而TNFR1的表达量没有明显变化,说明SGIV可能通过ORF050来调节细胞TNF和TNFR的表达,从而逃避宿主的免疫攻击。