红花种子cDNA文库构建及脂肪酸代谢相关基因的克隆

【目的】构建红花种子cDNA文库,挖掘红花脂肪酸代谢途径相关基因,为红花品质改良的基因工程研究奠定基础。【方法】以红花成熟种子为材料,通过Trizol法,提取红花种子总RNA,使用GeneRacer?Kit和CloneMinerⅡcDNA Library Construction Kit试剂盒构建cDNA文库。并对cDNA文库的重组率和插入片段进行鉴定,从中获得contig和singlet片段及脂肪酸代谢相关基因,通过荧光定量PCR,测定delt-12脂肪酸脱氢酶基因在不同开花时期(14,16,18,20d)红花种子中的表达量。【结果】构建的红花种子cDNA文库总克隆数为7.5×106,重组率95%,插入片段长度均500bp,全长基因比例达到20%。从红花cDNA文库中共拼接得到contig 543条,singlet 3 444条。delt-12脂肪酸脱氢酶基因序列在成熟红花种子中的表达量较其他时期高。【结论】成功建立了红花种子cDNA文库,克隆了delt-12脂肪酸脱氢酶基因,且该基因表达量在红花种子成熟过程中逐渐升高。     

紫外线照射辣椒叶片cDNA文库构建及部分防御信号基因cDNA的检测

对抗病的朝天椒地方品种,以紫外线(UV)处理叶片并提取叶片总RNA,采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了一个cDNA文库.该文库含有2.6×106个独立的噬菌斑克隆,扩增后滴度达到1.5×109pfu.μL-1,随机挑取的噬菌斑PCR检测发现重组率达90.0%.在搜索、拼接与植物WRKY、bZIP、AP2和E2等重要调节基因同源的辣椒表达序列标签(ESTs),获得重叠群的基础上,分别设计上述基因ESTs重叠群特异性引物,以cDNA文库为模板进行PCR扩增.结果表明,部分上述基因cDNA存在于文库中.因此,本研究所构建的文库可用于进一步分离响应UV的重要调节基因cDNA的分离.     

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

以玉米骨干自交系478为试验材料,从各生长时期的叶片中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米叶片全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.54×107转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.03×106pfu/mL,重组率为95%。     

小黑麦异多附加系M17叶片cDNA文库构建及抗小麦白粉病特异表达cDNA的差别筛选(英文)

以对小麦白粉病菌免疫的小黑麦异多附加系Ｍ１７（１Ｒ“６Ｒ”）为材料,一组接种小麦白粉病菌,另一组不接种．分别提取两组叶片的总ＲＮＡ,经磁珠法分离出ｐｏｌｙ（Ａ＋）ＲＮＡ,以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物,经反转录合成ｃＤＮＡ．将接种组双链ｃＤＮＡ克隆进λｇｔ１０载体,得到一个含９．８×１０４个重组噬菌体的ｃＤＮＡ文库．两组ｃＤＮＡ双链经切口平移法制成总ｃＤＮＡ探针,分别与ｃＤＮＡ文库杂交,通过差别筛选的方法,找到了６个与小麦白粉病抗性有关的ｃＤＮＡ克隆．     

小黑麦异多附加系M17叶片cDNA文库构建及抗小麦白粉病特异？…

以对小麦白粉病菌免疫的小黑麦异多附加系Ｍ１７为材料,一组接种小麦白粉病菌,另一组不接种。分别提取两组叶片的总ＲＮＡ,经磁珠法分离出ｐｏｌｙＲＮＡ,为Ｏｌｉｇｏ为引物,经反转录合成ｃＤＮＡ,将接种组双链ｃＤＮＡ克隆进入λｇｔ１０载体,得到一个含９．８×１０＾４个重组噬菌体的ｃＤＮＡ库。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

低温胁迫下山葡萄叶片酵母cDNA文库构建

【目的】葡萄栽培过程中,由低温造成的冷害或冻害严重影响葡萄的生长发育、果实品质和产量。山葡萄是葡萄抗寒育种的重要种质资源,本文通过构建低温胁迫下山葡萄叶片酵母cDNA文库,为葡萄抗寒分子机理研究提供物质基础。【方法】以抗寒山葡萄左山-1(V. amuerensis cv.Zuoshan-1)扦插盆栽苗为材料,提取4℃低温处理0、2、4、8、12、24 h后叶片总RNA,采用SMART技术反转录为cDNA,经纯化和短片段去除后克隆至pGADT7三框质粒载体上,经过纯化后获得初级cDNA文库,对初级文库进行扩增、提取文库质粒后转入酵母Y187菌株中,制作扩增的酵母文库,并对文库质量进行鉴定。【结果】经检测所构建的3个读码框初级文库库容分别为1.7×10⁶、2.0×10⁶和1.9×10⁶ cfu,重组率为100%,插入的片段长度主要分布在500～2 000 bp;电泳检测和测序结果表明,插入片段所对应的编码蛋白类型丰富,具有良好的多态性。最终获得的Y187酵母文库滴度为4.0×10⁸ cfu·mL     

玉米ZmAATP基因的克隆及遗传转化载体的构建

ATP-ADP转运蛋白(AATP)是质体内外能量供应和物质交换的重要载体,可以通过调节质体内外ATP浓度来影响质体内的合成代谢。本研究克隆了玉米ZmAATP基因,进化树分析显示ZmAATP蛋白与ATPase亲缘关系较近。进一步研发发现,授粉后随着玉米籽粒的发育和淀粉的积累,ZmAATP基因的表达量逐渐提高。另外,我们分别构建了由组成型启动子(Ubi)和胚乳特异型启动子(GluAI)驱动的ZmAATP基因的过量表达载体,为进一步研究该基因在玉米中的生物学功能奠定了基础。     

前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究

纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,该酶具有强烈溶栓活性.本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α,测序结果表明,所克隆片段全长1152bp,与GenBank中已报道序列同源性达100％.将目的基因片段与表达载体pBV220连接,构建重组表达质粒pBNK,转化大肠杆菌HB101.采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42℃和44℃)诱导表达,结果发现转化菌pBNK6-HB101在LB培养基中经30℃培养,42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的25.35％,转化菌pBNK6-HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养,无明显差异.     

田菁（Sesbania rostrata）cosmid基因组文库的建立和豆血红蛋白基因序列的克隆

利用mini-Ti质粒和λ噬菌体cos位点构建的植物cosmid载体,建立了茎瘤田菁cosmid基因组文库,并分子克隆了茎瘤田菁豆血红蛋白基因片段。改进了原有的方法,得到了植物大分子DNA片段和高效价的λ噬菌体体外包装物,为植物cosmid基因组文库的建立提供了关键的条件。菌落原位杂交筛选1.0×10#+5菌落,获得4个含有茎瘤田菁豆血红蛋白基因序列的阳性克隆。质粒DNA点杂交和Southern blot杂交进一步证明了田菁豆血红蛋白基因序列的克隆。     

玉米叶面积分布及估测

倒卵株型玉米单株叶面积的分布呈一单峰曲线，中部叶面积大，向上，向下叶面积逐渐减少，下层叶下降速度快于上层叶，１６叶组的第１０片叶，１７号组的第１１片叶，１８叶组的第１２片叶，１９叶组的第１２片叶，２０叶组的第１３片叶分别与该组单株叶面积密切相关，相关系数０．９０２２以上，决定系数超过０．８１４０。因此，可以通过这些叶片对单株叶面积的回归方程来估测单株叶面积，其估计值的准确性较高，估计方法简便。     

减蛋综合征病毒基因文库的构建

采用差速离心法纯化了鸭胚尿囊液中的减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）ＷＰＤＶ２０５病毒并提取了病毒基因组核酸。选用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ两种限制性内切酶对病毒基因组ＤＮＡ进行双酶切处理，结果产生７个片段，在这７个片段中，只具有ＢａｍＨⅠ酶切位点的片段有２个，只具有ＥｃｏＲⅠ酶切位点的片段有３个，具有双酶切位点的片段有２个。将其中的５个片段分别插入到ｐＵＣ１８相应多克隆位点中，建立了ｐＥＤＳＶＢＥ１、ｐＥＤＳＶＢＥ２、ｐＥＤＳＶＢ１、ｐＥＤＳＶＢ２、ｐＥＤＳＶＥ５个重组子，并对这５个重组子进行了酶切鉴定     

奶牛γ-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达

根据奶牛γ干扰素 ( Bov IFN-γ)基因的 c DNA序列设计 1对引物 ,应用一步法逆转录聚合酶链式反应 ( RT-PCR)技术从奶牛脾淋巴细胞的总 RNA中扩增出特异性片段。将 RT-PCR产物克隆到 Pucm-T载体中 ,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的 Bov IFN-γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体 PGEX-6P-1谷光甘肽 S 转移酶基因的下游 ,经 IPTG诱导后 ,表达出 42 ku的融合蛋白 ,薄层扫描测定可溶性融合蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的 2 5 %。通过细胞病变抑制试验证实 ,融合蛋白具有较好的生物学活性 ,在牛肾细胞上抑制水泡性口炎病毒的活性可达到 1 63 84U· mg- 1 ,有望成为预防和控制奶牛疾病的新产品。     

与油梨成熟有关的mRNA的分离及cDNA文库的构建

油梨果实在７℃下贮藏一定时期，取果实样品抽提总ＲＮＡ，通过ｏｌｉｇｏ ｄＴ纤维素柱纯化，获得ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ｍＲＮＡ，利用λＺａｐ－ｃＤＮＡ合成试剂盒合成双链ｃＤＮＡ，再将ｃＤＮＡ连接到克隆载体Ｕｎｉ－ＺａｐＸＲ上，构成与油梨果实成熟有关的ｃＤＮＡ文库，同时，利用纤维素酶和乙烯形成酶克隆探针，对文库作了筛选。     

肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因快速克隆和鉴定

以提纯的肠炎沙门氏菌染色体ＤＮＡ为材料,在一对含有ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡ的特殊引物引导下,应用ＰＣＲ扩增出鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ,ｍ,约１．８ｋｂ左右大小,然后以ＵＤＧ法快速克隆到质粒ｐＡＭＰ１０中,转化第１宿主大肠杆菌ＴＧ１或大肠杆菌ＤＨ５α,在氨苄青霉素平板上筛选转化子,小量制备重组质粒ＤＮＡ,再转入第２宿主大肠杆菌ＬＣ－２ａ（ｈａｇ－,ｒｅｃＡ－）,所有转化子均出现动力。其中的一个克隆ｐＡＭＰ·ＧＭ经动力和动力抑制试验、血清学试验、鞭毛电镜观察及部分序列测定,均证实ｐＡＭＰ·ＧＭ中载有肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ,ｍ。ｆｉｌＣｇ,ｍ克隆成功为寻求肠炎沙门氏菌防制新方法奠定了基础,研究中建立的快速克隆策略为广泛、深入地开展ｆｌｉＣ研究提供了便捷的新途径。     

玉米穗分化与叶龄关系的研究

春、夏、秋和晚秋玉米的各个播期中，以春玉米的全生育期最长，出苗至穗开始分化所需日数最多，穗分化经历日数最多。穗分化时期与展开叶两者之间表现出较稳定的同伸关系。叶龄指数与穗分化时期之间相关更为密切。