猪EIF2S3基因克隆测序及其组织表达谱分析

[目的]克隆猪EIF2S3基因mRNA全长,并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征,为研究真核翻译起始因子2(eIF2)蛋白γ亚基的生物学功能打下基础.[方法]以荣昌猪胸腺mRNA为模板,采用RCAE-PCR克隆EIF2S3基因的mRNA全长序列,在线完成各种生物信息学分析后,利用实时荧光定量PCR分析猪EIF2S3基因的组织表达特征.[结果]猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp,其中蛋白质编码区(CDS)长1419 bp,5'UTR区、3'UTR区分别长14和380 bp,编码472个氨基酸.EIF2S3蛋白分子量51.1 kD,理论等电点(pI)8.62,包含58个带正电的氨基酸和52个带负电的氨基酸,其前体蛋白靠近N端区域有一个强疏水区;EIF2S3蛋白的空间结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成.EIF2S3蛋白氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高(99.6%),其次是马、猫、牛、羊和人类(99.4%),与斑马鱼的相似性最低(96.6%).EIF2S3基因在猪的心脏、胸腺和淋巴组织中表达量较高,在脾脏和肌肉中呈中度表达,在肾脏中的表达量较低,而在肝脏中基本不表达.[结论]猪EIF2S3基因全长1813 bp,在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源,尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近;其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高,在肝脏中基本不表达,据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能,基本不发挥能量代谢功能.     

甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因（Sc-ERS）的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因（AY359578）、水稻乙烯受体ERS1基因（AY043031）编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

山羊痘病毒P32基因的克隆、测序及在原核细胞表达

为比较山羊痘病毒贵州分离株P32基因与国内外分离株的关系,并获得P32蛋白,应用PCR方法从贵州山羊痘病毒分离株的核酸样本中扩增出P32基因片段,将PCR产物克隆至pMDl8-T载体,对重组质粒进行了基因序列测定.将测定的P32基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中相应序列作比较,同源性分别达到99.4%和98.4%,表明山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性.将P32基因克隆至原核表达载体pET-28a,成功构建重组表达质粒pET-28a-P32/LD,转化至大肠杆菌BL2l(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE检测显示,重组细菌在35.5 kDa处表达一条特异性的蛋白带,而阴性对照未见这条蛋白带;Western-Blotting检测证实,这条蛋白带能与山羊痘高免血清反应而显示其免疫学活性.     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

内皮抑素基因的克隆及其序列测定

内皮抑素(endostatin)能抑制内皮细胞的增殖和转移.试验应用TD-PCR法从人胎盘中扩增Endostatin的cDNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,并进行克隆基因的序列分析.序列分析表明,该cDNA开放阅读框长555 bp,编码184个氨基酸残基的多肽序列,其编码序列与国外报道的相应序列基本一致.     

Cloning and expression of the human interleukin-6 (BSF-2/IFN beta 2) receptor

Interleukin-6 (IL-6/BSF-2/IFN beta 2) is a multifunctional cytokine that regulates the growth and differentiation of various tissues, and is known particularly for its role in the immune response and acute phase reactions. A complementary DNA encoding the human IL-6 receptor (IL-6-R) has now been isolated. The IL-6-R consists of 468 amino acids, including a signal peptide of approximately 19 amino acids and a domain of approximately 90 amino acids that is similar to a domain in the immunoglobulin (Ig) superfamily. The cytoplasmic domain of approximately 82 amino acids lacks a tyrosine/kinase domain, unlike other growth factor receptors.     

豚鼠ESR2基因新的可变剪接体克隆及序列分析

[目的]对豚鼠雌激素受体2(ESR2)基因进行克隆及序列分析,并预测分析其编码的蛋白序列,为提高豚鼠产仔性能及其育种打下基础.[方法]根据GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列(登录号XM003472337)设计引物,以豚鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PCR扩增ESR2基因编码区序列(CDS),利用生物信息学分析其编码蛋白氨基酸的组成及理化性质、二级结构及与相关物种的同源性.[结果]克隆获得的豚鼠ESR2基因CDS长度为1650bp,编码549个氨基酸,比参照序列(XM 003472337)少54个碱基,是ESR基因新的可变剪接体,且第7外显子缺失;蛋白质二级结构预测结果表明,豚鼠ESR2成熟肽包含α螺旋、β折叠和无规卷曲3种二级结构元件,由于缺失18个氨基酸导致蛋白质结构发生变异;同源性分析结果显示,豚鼠与长尾龙猫、奥氏更格卢鼠、马、达马拉鼹鼠、裸鼢鼠、鼠狐猴、八齿鼠、猪和人的ESR2基因序列同源性分别为91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%.[结论]克隆获得的豚鼠ESR2基因为新的可变剪接体,可作为研究豚鼠产仔性能及豚鼠育种重要的候选基因之一.     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

猪细小病毒VP2基因的克隆与序列测定

本研究以PCR方法成功扩增并克隆到BM－1株PPV结构蛋白的VP2基因的上、下游片段。通过VP2基因的序列测定，发现我国BM－1 PPV VP2基因序列与国外发表的序列（NADL－2、Kresse)的有一定差异。     

新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。     

柔嫩艾美耳球虫LZ株MIC-5基因的克隆与表达

提取柔嫩艾美耳球虫兰州株孢子化卵囊总RNA,运用RT-PCR技术扩增Et MIC-5基因片段进行测序,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达.结果表明,该基因片段长918 bp,编码306个氨基酸.与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫Houghton株MIC-5基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性为99.2%和99.6%.在推导的MIC-5氨基酸序列中,第15~89、90~160、173~242和245~306位保守的cys残基形成4个Apple样结构域(A-domain),推测该蛋白可能在虫体与宿主细胞的黏附中起重要作用.转化重组质粒pETMIC-5的BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blot分析证实目的蛋白成功表达,重组蛋白的表达量可占菌体蛋白的15.2%.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

葡萄VvGW2基因的克隆及表达

为了从葡萄品种美人指中克隆VvGW2基因,并对其结构特征及表达模式进行分析.在NCBI中查找与水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列,根据葡萄的GW2基因序列设计特异引物.采用改良CTAB法提取美人指花序中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆.利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;利用Bioxm2.6推测分析蛋白质分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;利用实时荧光定量RT-PCR研究该基因表达模式.结果显示,从美人指中克隆得到1个GW2基因同源序列,命名为VvGW2基因.VvGW2基因开放阅读框长度为1 272 bp,共编码423个氨基酸,预测蛋白质分子量为46 960,理论等电点为4.68.该基因编码的氨基酸具有GW2蛋白质保守的环指结构域,该环指蛋白质为C5HC2类型.与GenBank中登录的其他植物GW2蛋白质序列相似性为47％ ～53％.根据VvGW2基因所编码的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,葡萄与可可聚为一类.实时荧光定量RT-PCR分析结果显示,VvGW2基因在美人指花或果实的各时期均有表达,其中在开花期基因表达量最高.不同葡萄品种中,VvGW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种美人指的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低.表明VvGW2基因在不同时期和不同品种中的表达量差异可能与葡萄果实形状相关.     

人瘦素基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR从人的脂肪组织中克隆了人OB基因,并将其在原核生物E.coli BL21(DE3)中重组表达,采用SDS-PAGE法检测表达情况,鉴定表达产物。结果表明,人瘦素在大肠杆菌中表达量占总蛋白的20%左右,为瘦素的进一步研究奠定了基础。     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

荣昌猪TYR基因的克隆测序及多态性检测

根据人、猪、牛的酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因部分序列(GenBank:AF237808,AF237809,AF181962,AY046527),利用Oligo6.0软件设计5对引物,对荣昌猪的TYR基因进行了PCR扩增,并用单链构象多态分析(SSCP)方法进行了多态性检测。结果发现,外显子1呈多态,其余3个外显子均呈单态。克隆测序首次得到猪的酪氨酸酶基因外显子2,3,4的部分序列(序列已被GenBank收录,登录号分别为AY236997,AY279998,AY242973),而且发现外显子1的多态是由于起始密码子上游第46位的G突变成A造成的。     

Molecular characterization of the human beta 3-adrenergic receptor

Since the classification of beta-adrenergic receptors (beta-ARs) into beta 1 and beta 2 subtypes, additional beta-ARs have been implicated in the control of various metabolic processes by catecholamines. A human gene has been isolated that encodes a third beta-AR, here referred to as the "beta 3-adrenergic receptor." Exposure of eukaryotic cells transfected with this gene to adrenaline or noradrenaline promotes the accumulation of adenosine 3',5'-monophosphate; only 2 of 11 classical beta-AR blockers efficiently inhibited this effect, whereas two others behaved as beta 3-AR agonists. The potency order of beta-AR agonists for the beta 3-AR correlates with their rank order for stimulating various metabolic processes in tissues where atypical adrenergic sites are thought to exist. In particular, novel beta-AR agonists having high thermogenic, antiobesity, and antidiabetic activities in animal models are among the most potent stimulators of the beta 3-AR.     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析

根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的 16个苏云金芽孢杆菌 (Bt)菌株进行检测.结果显示, 15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt8010肠毒素entS基因的编码框 (ORF)序列, 将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有 12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.