转基因抗草丁膦油菜籽检测方法研究

应用PCR技术，测试抗草丁膦杂交油菜籽中转入的外源抗草丁膦除草剂基因（BAR）、雄性不育基因（BARNASE）和恢复基因（BARSTAR），通过对PCR产物进行克隆和测序，建立了检测转基因抗草丁膦油菜籽的技术和方法。     

转基因抗草甘膦油菜籽中草甘膦氧化还原酶基因的检测方法研究

应用PCR技术，分析草某膦氧化还原酶基因（GOX）和修饰草甘膦氧化还原酶基因的核苷酸序列及表达蛋白质的氨基酸序列，建立了检测转基因抗草甘膦油菜籽中草甘膦氧化还原酶基因的技术和方法。     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR检测

研究成功建立了痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR(Semi-nested PCR)检测方法，灵敏度比常规PCR提高了100倍。该方法通过改良CTAB法提取并纯化得到不同梯度浓度的DNA模板溶液。设计了4个外源基因的特异性半巢式PCR引物，以油菜籽磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)为内标准基因，对油菜籽混合样品中外源FMV35S启动子、GOX、BARSTAR和BARNASE基因进行了检测，灵敏度达到0.001%。     

抗虫抗除草剂转基因水稻恢复系B2A68的培育

利用人工优化合成的抗虫基因Cry2Aa#与抗除草剂的Bar基因构建的植物表达载体转化水稻恢复系D68,经过分子鉴定获得1个单拷贝的转基因水稻株系B2A68。B2A68和杂交种株1S/B2A68叶片中Cry2Aa蛋白的表达量在齐穗期分别为10.45～26.84和9.0～13.45μg/g。草铵膦抗性试验和抗虫性测定结果显示,转基因水稻B2A68既抗除草剂草铵膦,又抗稻纵卷叶螟。     

利用改良的草丁膦筛选系统快速而有效筛选转基因大豆

为提高大豆(Glycine max(L.)Merrill)遗传转化效率建立了一种快速而有效的草丁膦筛选系统.将刺伤的子叶节外植体接种于含有pCAMBIA3201载体的LBA4404农杆菌溶液.目前利用草丁膦筛选转基因大豆的常规方法是在含有5 mg/L草丁膦的芽诱导培养基和含有3～5 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.利用此常规筛选方法所获得的大多数植株是非转化体,从而导致转化效率变低,为1.6%;而且这种方法极大地延迟了芽的伸长过程,使多数不定芽的伸长发生在农杆菌处理后的21～41周.为此,对常规草丁膦筛选方法进行了改良.首先将外植体放置在不含有除草剂的芽诱导培养基上培养3周,然后转到含有4 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.此时,多数不定芽仅在7～12周内便可伸长.当芽长到3～5 cm时,从外植体上切下来转到含有1～5 mg/L草丁膦的根诱导培养上进行进一步的筛选.结果表明,在添加有3 mg/L草丁膦根培养基上,转化效率达到最大值为6.7%.不定芽对根培养基中的除草剂反应迅速,仅在10d天内所有非转化体都变枯死亡.利用这种改良的筛选系统,大多数转基因植株仅在8～16周内便可获得.Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中.GUS检测和除草剂抗性分析结果表明,被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达.     

大豆对草丁膦敏感性研究

分析了大豆品种东农50对不同浓度草丁膦(Glufosinate)的敏感性表现。结果表明:施用50 mg.L-1草丁膦后3 d东农50开始表现枯黄、萎蔫,随着浓度增大毒害作用增强,扩散整个叶片;子叶、茎、真叶不同位置的草丁膦处理显示新叶、子叶对草丁膦最敏感,茎的敏感性最低;全株喷施75 mg.L-1草丁膦时可直接观察到草丁膦对叶片的毒害作用,二次喷施效果显著,易于观察。     

利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数

水稻转化过程中,多个拷贝数整合到基因组中影响遗传稳定性和基因表达。传统的Southern杂交检测法鉴定费时费力,不适合目前高通量和自动化的检测要求。因此研究通过比较定量除草剂草铵膦抗性基因(bar)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2,建立了基于实时荧光定量PCR的拷贝数检测法。利用此体系对9个独立的异天冬氨酸甲基转移酶OsPIMT1转基因T0代植株进行了荧光定量分析,其中6个为单拷贝,3个为双拷贝,经过Southern杂交和分离比分析验证,表明该方法能够快速,准确的鉴定水稻含有草铵膦抗性基因的水稻转基因植株。     

抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子4代的适合度

为深入研究抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交后代适合度,分析抗性基因是否渗入近缘杂草野芥菜中,研究了抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子4代(BC3F_5)在2种种植方式(单种,野芥菜与回交后代等比例混种)及2个种植密度(低密度为15株/3m2,高密度为30株/3m2)下的适合度。结果发现,在单种和低密度等比例混种条件下,抗性BC3F_5的各适合度成分以及总适合度均已达到与野芥菜相当的水平;在高密度等比例混种时,BC3F_5R(抗草甘膦的BC3F_5)与野芥菜的各适合度成分以及总适合度均无显著差异,但BC3F_5L(抗草丁膦的BC3F_5)的主要适合度成分和总适合度均显著低于野芥菜。相关性分析结果表明,野芥菜和抗性BC3F_5的主要适合度成分与种植密度显著相关。因此结论认为,抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子4代在自然环境条件下的生存能力强,抗草甘膦转基因油菜的抗性基因漂移到野芥菜可能引起的生态风险比抗草丁膦转基因的生态风险更大。因此防范转基因作物的基因逃逸不仅要防范转基因作物与近缘杂草的初始杂交,而且要防范杂交后代与杂草的回交。     

转基因玉米MON87427/zSSIIb 二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准 物质，实现对DNA分子的绝对定量，已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法，获得 准确测量结果，本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料，探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的 聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品，将5个不同的玉米内标基因分别与 MON87427组合，通过优化退火温度，根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值 的一致性等，确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb，最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的 动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测，二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性， 表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。     

核酸酶BN基因的克隆及序列分析

从解淀粉芽孢杆菌中提取染色体ＤＮＡ，经过ＰＣＲ扩增得到Ｂａｍａｓｅ（核酸酶ＢＮ）基因，然后克隆到质粒Ｐ＾ＧＥＭ－７２ｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点上并进行序列分析。结果表明，核酸酶ＢＮ基因的核苷酸序列与已报道的序列相比具有９９．７％的同源性，长度为３３６ｂｐ，根据核苷酸序列推断的氨基酸序列则完全一致。该工作为以后利用核酸酶的特异表达来获得雄性不育植物打下了基础。     

利用基因枪转化法获得受四环素调控的水稻雄性不育植株

利用基因枪法通过pTET-BI-Bar和pTATx-BN-Bin质粒分别将TetR和Barnase基因共转化粳稻品种台北309、4008S和籼稻品种D68。通过对R0代植株不同的基因进行PCR及Southern分析,结果表明,Barnase、TetR基因和控制Barnase基因的TA29-TX启动子均已整合到水稻基因组。其中,台北309和4008S分别获得了15株和6株阳性转基因植株,其外源基因转化率分别为4.5%和1.9%,其外源基因TetR和Barnase的共转化率分别为0.6%和0.3%。D68没有获得阳性转基因植株。     

雄性不育及育性恢复基因表达载体的构建

将拟南芥花药特异表达启动子A6与核酸酶基因融合构建不育基因,与核酸酶Bamase特异抑制剂Barstar基因融合构建育性恢复基因,再分别与抗除草剂溴苯睛基因表达盒bxn串联,形成紧密连锁,分别构建植物雄性不育和育性恢复基因表达载体pwP一AN及pwp一AS,以抗澳苯睛基因作为转化和繁殖、制种过程的筛选标记。     

甘蓝型油菜ＨＭＧ基因家族的生物信息学分析

为研究甘蓝型油菜HMG（high mobility group）基因家族的起源、进化和功能,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜和其近缘物种HMG基因家族进行鉴定,并对其进化、基因结构、组织表达、直系旁系同源基因进行系统分析。在甘蓝型油菜中鉴定到45个HMG家族成员,并根据进化树和基因结构将其分成5组。染色体定位发现,19条染色体中有18条染色体有HMG基因,说明该家族基因分布较广泛。在甘蓝型油菜与甘蓝、白菜和拟南芥分别鉴定到47、45和26个直系同源基因对。在甘蓝型油菜中鉴定到28个旁系同源基因对,而在其它3个物种中则比较少,这可能与甘蓝型油菜的多次基因组加倍有关。对45个甘蓝型油菜BnHMG基因在根和叶中的表达模式进行分析,结果显示,大多数基因在根和叶中均有表达,且呈现出不同的表达模式。     

苦瓜蛋白MAP30基因转化番茄的研究

采用CTAB法提取苦瓜叶片总DNA,经PCR扩增、产物克隆及序列测定,获得序列正确的MAP30基因。构建植物表达载体,转化农杆菌,农杆菌工程菌株侵染番茄子叶,诱导出愈伤组织,并分化出芽和根,抗性植株经分子检测,得到在转录水平上表达MAP30基因的转基因番茄植株。     

用RAPD技术鉴定橡胶树抗白粉病基因连锁标记

用52种RAPD引物对橡胶树11个抗白粉病品系和11个感病品系基因组DNA进行RAPD分析,找到了一个和橡胶树抗白粉病表型密切相关的DNA片段,此片段长390bp,命名为opv—390。opv—390为11个抗性品系所共有和11个感病品系所没有。用ECL(enhanced cheminesence)酶标法标记抗性品系RRIC52(CK)的OPV390为探针,经Southern blot表明,该序列在6个抗性品系中均为单一拷贝或低拷贝,而感病品系皆不含此序列,由此看来,OPV—390可作为橡胶树抗白粉病基因紧密连锁的RAPD标记。这为今后钓取橡胶树抗白粉病基因的工作打下了基础。     

Transferring Translucent Endosperm Mutant Gene Wx-mq and Rice Stripe Disease Resistance Gene Stv-bi by Marker-Assisted Selection in Rice (Oryza sativa)

A high-yielding japonica rice variety, Wuyunjing 7, bred in Jiangsu Province, China as a female parent was crossed with a Japanese rice variety Kantou 194, which carries a rice stripe disease resistance gene Stv-bi and a translucent endosperm mutant gene Wx-mq. From F2 generations, a sequence characterized amplified region (SCAR) marker tightly linked with Stv-bi and a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker for Wx-mq were used for marker-assisted selection. Finally, a new japonica rice line, N...     

大豆乙酰羟基酸异构还原酶基因GmAHRI的克隆与分析

基于电子克隆获得的大豆GmAHRI基因cDNA序列编码区设计特异引物,以高异亮氨酸大豆品种“和龙早熟豆”总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1764 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定.测序结果显示:GmAHRI基因家族有2个成员,分别命名为GmAHRI1( FJ594399.1)和GmAHRI2( JN...     

分子标记辅助选择聚合水稻暗胚乳突变基因Wx-mq和抗条纹叶枯病基因Stv-b~i

以江苏高产粳稻品种武运粳7号为母本,具有条纹叶枯病抗性基因Stv-bi和暗胚乳突变基因Wx-mq的日本粳稻品种关东194作父本配制杂交组合进行聚合育种。利用与Stv-bi基因共分离的SCAR标记及与暗胚乳突变基因Wx-mq紧密连锁的CAPS功能标记对其分离世代进行标记位点的检测,结合田间多代选育、抗性鉴定和籽粒胚乳外观鉴定,将条纹叶枯病抗性基因Stv-bi和暗胚乳突变基因Wx-mq同时转育到高产品种中,筛选、培育出优质、抗病、高产且农艺性状优良的水稻新品系宁9108。利用与水稻优质及抗病基因紧密连锁的分子标记,不仅初步建立了优质、抗病育种的分子标记辅助选择体系,也为水稻优质、抗病、高产育种提供了一种简单、快捷的选择方法和重要的中间材料。     

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。