猪胚胎细胞核移植重组胚发育能力的研究

选用香猪2-～16-细胞期卵裂球作核供体,上海白猪卵母细胞作核受体.通过显微操作和电融合技术构成重组胚.体外培养时,以融合前1h激活、融合前2h激活及融合前不激活的卵母细胞作核受体的重组胚,发育率分别为65.8%,53.1%,33.3%.以体内、体外成熟卵母细胞作核受体胞质时,其重组胚的发育能力无显著变化(P＞0.05).作为核供体的胚胎对于重组胚的发育能力有显著影响,母体合子转变以后的胚胎作为核供体时,重组胚的发育能力下降;分别以不同细胞期胚胎(2-,4-,8-和16-细胞)的卵裂球作为核供体的NT胚发育率有显著差异(P＜0.05),以2-～4-细胞胚胎卵裂球作核供体最合适.     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。     

供体细胞的传代次数和不同处理方法对异种核移植效率的影响

实验旨在探讨供体细胞培养代数及其所处的细胞周期对异种核移植效率的影响.以经Hochest33342染色后去核的牛卵母细胞为受体,以处于不同细胞周期的不同代数的人成纤维细胞为供体,采用电融合方法构建重构胚,6-DAMP和乙醇激活重构胚,SOFaa培养液中培养.第20代细胞非饥饿组的融合率、发育率显著低于第20代饥饿组（P＜0.05）,极显著的低于第8代细胞的饥饿组和非饥饿组（P＜0.01）,而8-细胞胚胎率,囊胚率4组间无显著差异.结果表明,饥饿处理对于培养代数低的细胞来说可能是非必要因素,但对于高代次细胞则是提高核移植效率的必要步骤,饥饿处理可使核移植融合率和发育率显著的提高.     

共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响

以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞,以延边黄牛MⅡ期去核的卵母细胞作为受体进行体外培养.使用CR1aa培养液培养时卵裂率(83.7%)显著高于TCM-199液和mSOF液组(76.9%和77.4%),但在重组胚的早期发育各阶段都不存在统计学差异(p>0.05).以CR1aa和TCM-199为基础液时,输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养在卵裂率及重组胚的各阶段发育率都有显著提高(p<0.05).结果表明:CR1aa培养液适用于延边黄牛重组胚的体外培养,以CR1aa液 输卵管上皮细胞和TCM-199液 颗粒细胞共培养的形式效果更好(p<0.05).     

谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对克隆重组胚发育率的影响.试验中选择成熟培养20～22 h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的卵母细胞在添加不同浓度谷氨酰胺的体外培养液中进行培养.结果显示,体外培养液中添加浓度为1....     

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。     

血清饥饿对兔成纤维细胞生长的影响

用含体积分数０．５％血清的ＤＭＥＭ直接饥饿胎儿及皮肤成纤维细胞，细胞数先是略有增长，然后逐渐下降。胎儿和皮肤成纤维细胞在血清梯度饥饿期间，更换含体积分数为４％，２％和１％血清的ＤＭＥＭ，细胞仍缓慢增长；更换含体积分数为０．５％血清的培养液后，细胞数逐渐降低。血清饥饿成纤维细胞后，细胞直径明显小于对数生长期的细胞（２０，１９ＶＳ３６μｍ，Ｐ〈０．０１）。血清饥饿的成纤维细胞，ＰＣＮＡ单抗染色阴性，证     

血清饥饿对兔成纤维细胞生长的影响

用含体积分数０．５％ 血清的ＤＭ ＥＭ 直接饥饿胎儿及皮肤成纤维细胞,细胞数先是略有增长,然后逐渐下降。胎儿和皮肤成纤维细胞在血清梯度饥饿期间,更换含体积分数为４％ ,２％ 和１％ 血清的ＤＭＥＭ,细胞仍缓慢增长;更换含体积分数为０．５％ 血清的培养液后,细胞数逐渐降低。血清饥饿成纤维细胞后,细胞直径明显小于对数生长期的细胞（２０,１９ＶＳ３６ μｍ ,Ｐ＜ ０．０１）。血清饥饿的成纤维细胞,ＰＣＮＡ 单抗染色阴性,证明离开了细胞周期,进入Ｇ０ 期,该期的细胞仍保持着活力     

精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对重组胚发育的影响。选择形态良好排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后开始融合、激活,最后在添加不同浓度(0、0.061、0.132、0.264mmol/L)精氨酸的培养液中培养。结果发现,对照组与处理组之间重组胚的卵裂率和8-16C的发育率差异不显著,而囊胚的发育上,0.061mmol/L处理组显著高于对照组。表明体外培养液中添加精氨酸后能够促进体细胞克隆重组胚的发育。     

谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在培养液中添加一定浓度的谷氨酸对延边黄牛克隆重组胚发育的影响。选择成熟了20～22 h并且排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核,然后进行体外培养,观察卵母细胞的卵裂以及囊胚发育情况。结果显示,低浓度的谷氨酸能够提高重组胚的卵裂率,高浓度则抑制卵母细胞的卵裂;而囊胚的发育方面,低浓度的谷氨酸会降低其发育率。所以,添加适量浓度的谷氨酸能够提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率。     

牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

研究了体外培养液中添加不同浓度的牛磺酸对重组胚发育率的影响。试验中设计了4个牛磺酸浓度组,分别是0、7.0、14.0、21.0 mmol/L。各浓度组之间的卵裂率没有差异,其中低浓度组7.0 mmol/L的囊胚发育率较其他组高,随着浓度的上升囊胚发育率逐渐降低。体外培养液中添加牛磺酸的最佳浓度为7.0 mmol/L,能够显著提高延边黄牛体细胞克隆牛重组胚的发育率。     

不同培养条件对牛核移植胚胎体外发育的影响

[目的]进一步优化牛核移植胚胎的体外培养体系。[方法]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0~3 d采用5%O2浓度,在不同培养条件下对牛核移植重构胚胎进行体外培养,测定卵裂率8、细胞发育率、桑椹胚率以及囊胚发育率。[结果]结果表明,试验组B的8细胞发育率(38.3%)、桑椹胚率(17.0%)和囊胚率(8.5%)与对照组A(17.9%、1.3%、1.3%)差异显著(P<0.05)。试验组B和试验组C的桑椹胚率(17.0%、11.8%)、囊胚率(8.5%、7.8%)与对照组A(1.3%、1.3%)均差异显著(P<0.05)。[结论]在培养液中添加谷胱甘肽和胚胎培养的0~3d采用低O2浓度(5%O2),能够提高牛核移植胚胎的体外发育率。     

黄牛供体细胞处理及冷冻保存对核移植率的影响

本试验以延边黄牛耳部皮肤成纤维细胞作为核移植供体细胞,研究不同的供体处理方式对体细胞核移植胚胎发育的影响。使用血清饥饿和汇合处理供体细胞,并进行了体细胞的冷冻保存,研究冷冻后的核移植效果。结果显示:(1)使用血清饥饿处理和汇合处理后,均能提高重组胚的卵裂率及囊胚发育率。(2)未冷冻组重组胚卵裂率及囊胚发育率显著高于冷冻组(P<0.05)。     

油松胚性愈伤组织成熟培养的影响因素

以油松的胚性愈伤组织为材料,利用单因素试验设计探究ABA质量浓度、PEG质量浓度、植物凝胶质量浓度、糖的种类和其质量浓度对油松体细胞胚成熟率的影响;在此基础上采用正交试验筛选出最佳培养条件。单因素试验结果表明,成熟培养基中ABA质量浓度14~18 mg·L^-1、PEG质量浓度50~100 g·L^-1、植物凝胶质量浓度2.5~5.0 g·L^-1、麦芽糖和蔗糖质量浓度组合(15+25)g·L^-1时,体细胞胚的成熟效率较高;正交试验结果表明,成熟培养基中ABA质量浓度16 mg·L^-1、PEG质量浓度75 g·L^-1、植物凝胶质量浓度5 g·L^-1、麦芽糖和蔗糖质量浓度(10+30)g·L^-1时,油松体细胞胚的成熟效率提高了0.8倍。     

不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导的影响

[目的]建立高效的西洋参胚性愈伤组织诱导体系.[方法]以裂口的西洋参种子为试材,研究不同激素对西洋参种胚脱分化启动与愈伤组织诱导的影响,并分析其体胚发生过程.[结果]不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导效果存在明显差异,当培养条件为MS+2,4-D0.5mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 0.5mg/L时,愈伤组织诱导率最高为96.4％;在解剖显微镜下观察,西洋参体胚发生过程中球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚清晰可见.[结论]该研究为西洋参快繁体系的建立和优化奠定一定的理论基础.     

几种中药粗提物对鸡胚成纤维细胞生长的影响

为筛选抗IBDV方剂的主药,采用组织培养方法,测试了黄芪、连翘等8种中药粗提物在体外鸡胚成纤维细胞(CEF)上的最大安全浓度及其对CEF增殖、存活时间的影响。结果显示,黄芪对CEF基本无毒性作用,最大安全浓度为25mg/ml,而连翘等其余7种中药粗提物则表现出较大的毒性作用,最大安全浓度极低,同时,黄芪对CEF还具有较强的促生长和延长存活时间的作用。因此,筛定黄芪作为抗IBDV方剂的主药。     

外源激素对小麦成熟种子体细胞胚发生的影响

研究了外源激素对不同小麦品种成熟种子体细胞胚发生的影响。结果表明：2,4-D明显促进小麦胚性愈伤组织的发生,其诱导效应表现出基因型间的差异。诱导体胚发生的最适宜浓度为2,4-D 2．0～4．0 mg·L~1,附加KT对胚状体的萌发有显著的促进作用。另外,及时调整培养基,适当的降低激素含量对体胚的诱导也非常重要。晋农211在2,4- D2．0 mg·L~1的MS培养基上,45 d后转移至2,4-D浓度1．0 mg·L~1+KT0．5 mg·L~1的培养基上胚状体诱导率较高。农大981胚性愈伤组织在2,4-D2．0 mg·L~1的MS培养基上,50 d降低2,4-D浓度至1．0mg·L~1+KT0．5 mg·L~1胚状体诱导率较高。     

siRNA对鸡胚成纤维细胞中GAPDH基因表达的抑制作用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过短双链RNA(small interference RNA,siRNA)介导的特异性抑制相应基因表达的新技术。作为研究基因功能的有效手段,该技术已在线虫、果蝇、斑马鱼和鼠等动物中进行了应用。本研究利用体外转录合成的短双链干扰RNA(siRNA),针对鸡的管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),在鸡胚成纤维细胞中对其表达进行干扰。结果显示siGAPDH能有效阻断GAPDH基因在鸡胚成纤维细胞中的表达,而不相关的siRNA则对该基因的表达没有影响,证明在鸡细胞中也存在RNA干扰现象,为利用RNAi技术对鸡的基因功能研究奠定了一定基础。