利用基因组发掘技术指导链霉菌SH-62中活性天然产物的分离及鉴定

通过生物信息学分析,利用基因组发掘技术发现链霉菌SH-62基因组中至少含有37个次级代谢产物的生物合成基因簇,除了有4个基因簇分别与已知的肠道菌素、潮霉素A、尼日利亚菌素和格尔德霉素的生物合成基因簇具有高度同源性以外,其他基因簇的功能鲜见报道。在不同发酵培养基上培养链霉菌SH-62,利用高分辨率的LC-MS对发酵产物进行分析,发现链霉菌SH-62确实能够产生肠道菌素、潮霉素A和尼日利亚菌素,从而证明了基因组发掘策略确实能够指导代谢产物的分离及鉴定。     

链丝菌素生物合成基因簇的克隆及其异源表达

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。     

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4(6)的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶(PKS)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4(6)的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。     

硫藤黄链霉菌基因组表达文库的构建及筛选

为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制,以链霉菌整合型质粒pJTU2554为载体,构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主,通过生物活性筛选获得9株具有抑菌活性的异源表达突变菌株,同时通过PCR筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。TLC及HPLC-MS分析发现6个携带有aureothin生物合成基因簇的cosmid,通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素aureothin,证实文库异源表达及筛选的有效性。     

变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建

以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。     

井岗霉素在天蓝色链霉菌M145中的异源表达

井岗霉素对水稻纹枯病有良好的防治作用,在我国得到广泛使用。通过结合转移的方法把包含井岗霉素生物合成全基因簇的柯斯质粒9A2导入天蓝色链霉菌M145(Streotpmyces coelicolor M145)中,然后将含有导入质粒的菌株M145/9A2进行发酵,对发酵液进行生物测定的结果显示此菌株发酵液对指示菌水稻纹枯菌有抑制作用,进一步质谱检测结果表明,在天蓝色链霉菌中异源表达井岗霉素成功。     

密旋链霉菌Act12中四氢嘧啶合成基因簇的鉴定及其功能分析

【目的】对生防密旋链霉菌Act12中的四氢嘧啶合成基因簇进行鉴定及功能分析。【方法】对田间生防效果良好的密旋链霉菌Act12进行盐耐受能力检测,采用体积分数80%的乙醇抽提其胞内四氢嘧啶,分别通过TLC和HPLC进行定性及定量检测四氢嘧啶。通过Act12全基因组分析,克隆得到Act12中四氢嘧啶生物合成基因簇ectABC,将其与表达载体pET-28a连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,检测工程菌株的盐耐受能力。【结果】密旋链霉菌Act12可在NaCl质量分数为0%~10.0%的条件下生长,且能够生产相关耐盐相容性溶质四氢嘧啶。当NaCl质量分数为2.5%时,密旋链霉菌Act12胞内的四氢嘧啶积累量达到最大值,为72.39mg/L。生物信息学分析结果表明,组成ectABC基因簇的3个基因ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,分别编码二氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶。通过克隆得到长2 408bp的ectABC基因簇,并使其成功在大肠杆菌中实现异源表达,通过Ni柱纯化得到了EctA蛋白。但含pET28a-ectABC的大肠杆菌BL21(DE3)在本试验条件下,其盐耐受能力并无明显改善。【结论】生防链霉菌Act12中存在四氢嘧啶合成基因簇ectABC,且能够在大肠杆菌中成功异源表达。     

全局调控基因对抗生素生物合成的影响

抗生素主要是由链霉菌发酵产生的,其生物合成受到严格和复杂的调控,全局调控就是其中重要的一类调控机制,在链霉菌中广泛存在,且作用方式多样、作用机制复杂。就近年来链霉菌中抗生素生物合成全局调控的研究进展进行综述,旨在对进一步阐明链霉菌次级代谢调控机制,并利用基因工程手段提高次级代谢产物产量及新型高产抗生素药物的研发有所裨益。     

接合转移技术将外源DNA大片段引入变铅青链霉菌中的研究

为了发展一种将150 kb及以上的外源DNA片段引入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的有效方法,以大肠杆菌-变铅青链霉菌穿梭细菌人工染色体为载体,将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个150~180 kb的外源DNA片段期望以接合转移的方式从大肠杆菌宿主菌(Escherichia coli ET12567/p UZ8002)中横向转移入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK23菌株中。结果表明,接合转移技术能够有效地将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个外源DNA大片段引入到变铅青链霉菌基因组中并稳定传代。     

波卓霉素生物合成基因簇的异源表达及产量提高

波卓霉素是从波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis)中分离得到的,具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性,尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库,PCR筛选获得包含完整波卓霉素合成基因簇的柯斯质粒4E11,通过接合转移的方法把4E11转化至天蓝色链霉菌M145中,对获得的异源表达株M145/4E11进行发酵,通过提取纯化和HPLC-MS检测,表明M145/4E11发酵液中产生了波卓霉素;试验并通过Red/ET重组系统,以红霉素启动子(ermE*P1)替换了波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前提肽合成基因btmD的启动子,成功实现异源表达株M145/4E11波卓霉素的产量提高。     

变青链霉菌DNA的研究——Ⅰ.电泳过程中的特异性降解

变青链霉菌基因组DNA和质粒DNA在某些特定批号的电泳缓冲液中电泳时,双链DNA遭到很强的降解。变青链霉菌基因组DNA受到有限切割而产生的DNA片段的平均大小为6kb左右。天兰色链霉菌A3(2)和好几种其它链霉菌菌株的DNA,以及大肠杆菌的DNA在同样条件下并不受这种切割的影响。已经证明,这种特异性对变青链霉菌DNA的切割不是由于缓冲液中污染了微生物,进而产生核酸酶所致,而是由于某些批号的EDTA商品中污染了Fe~(2+)所致。变青链霉菌中DNA制备物“较差”的许多报道可能都是上述原因所致。     

弗氏链霉菌tylF基因的克隆及其生物信息学分析

[目的]研究弗氏链霉菌tylF基因的克隆及其生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR技术、巢式PCR技术和RACE技术从弗氏链霉菌B-62169菌株中克隆获得tyl F基因的全长c DNA序列,并对其生物信息学进行分析。[结果]经Vector NTI 11.0软件拼接获得tyl F基因全长c DNA序列长度为1 245 bp,并带有19 bp长的Poly(A)尾巴,包含927 bp的开放读码框(ORF),编码一个含309个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明,tyl F基因编码的酶是大菌素-O-甲基转移酶,参与分子功能中甲基转移酶活性和生物学途径中甲基化过程。对tyl F基因全长c DNA序列进行蛋白质结构域分析,证实该基因编码Tyl F蛋白,并具有223个氨基酸蛋白结构域。[结论]该研究为阐明泰乐菌素生物合成过程中甲基化反应机理,更进一步研究大环内酯类抗生素生物合成代谢途径提供生物信息学数据支持。     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

肉色吸水链霉菌SH121接合转移系统的建立

利用单因素试验探索了热激处理、预萌发时间、供体宿主菌的类型、供受比及MgCl_2浓度对链霉菌SH121接合转移效率的影响,结果显示:在50℃热激10min,37℃预萌发1h,以大肠杆菌DCDA/pUZ8002为供体宿主菌,在供受比为100∶1时,使用添加40mmol/L MgCl_2的培养基M-ISP4,接合转移效率最高可达到每受体1.03×10~(-3)个接合子。利用建立好的接合转移方法,将整合型质粒pSET152和基因敲除质粒pYZ09成功地导入链霉菌SH121,证实该方法可用于后期链霉菌SH121活性天然产物的挖掘及其相关生物合成基因簇的研究工作。     

吸水链霉菌新种的筛选和鉴定

从土壤中分离得到一株产生对叶螨等有高活性抗生素的新链霉菌株。该抗生素对各种叶螨(红蜘蛛)、蚜类等都有较高的防治效果。通过对该菌株进行形态特征、培养特征、生理生化、细胞壁组份分析及16S rDNA序列分析,确定该菌种为吸水链霉菌的一株新菌,命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengensis.n.sp.)     

过表达根瘤血红蛋白基因对活跃链霉菌那西肽产量的影响

[目的]采用过表达根瘤血红蛋白基因改善活跃链霉菌的溶氧表达,以提高那西肽的产量。[方法]通过全基因组合成的方法得到根瘤菌血红蛋白基因(sm),连接到整合型质粒p IB139上,构建表达载体p IB139-sm。通过大肠杆菌-链霉菌结合转移的方法将sm基因整合到活跃链霉菌基因组上,通过PCR验证各转化子目的片段已整合到活跃链霉菌基因组上,并进行大量筛选得到重组菌株。[结果]经SDS-PAGE和CO结合差示光谱分析,结果显示,目的蛋白均已成功表达且具有相应的蛋白活性。摇瓶培养结果显示,Smf Hb表达对菌体生长和那西肽产量有明显的促进作用,过表达Smf Hb的重组菌株那西肽产量达1 245.7μg/m L,比原始菌株提高39.6%。[结论]过表达sm基因提高那西肽产量的作用优于vhb。     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

罗中链霉菌耐碱菌株一新亚种的多相分类及基因组分析

耐碱微生物是新天然产物的重要来源,TRM49041是从新疆罗布泊地区渠沟沉积物中分离的一株耐碱菌株,可在pH8～10环境下正常生长。为探究该菌株分类学地位及代谢潜能,本研究从菌株形态特征、基因型特征、生理生化特征以及化学特征等方面对其进行鉴定,同时,对该菌株进行全基因组测序及分析。结果表明其具有链霉菌的典型特征,与罗中链霉菌相似,但又有明显区别,根据其特性确定为罗中链霉菌的新亚种,命名为罗中链霉菌耐碱亚种(Streptomyces luozhongensis subsp.alkalitolerant);其基因组全长为7 019 135 bp,共编码6 212个基因,GC含量为73.99%;通过antiSMASH预测分析,发现其中存在27个潜在的次级代谢产物生物合成基因簇,具有产生链霉素、衣霉素、星孢菌素、Ikarugamycin、JBIR-126和尼日利亚菌素的潜力,是一株新型化合物挖掘的候选菌株。菌株的鉴定及基因组分析为丰富物种资源库及次级代谢产物的深度挖掘奠定了理论基础。     

金属离子对褐黄孢链霉菌生长和纳他霉素生物合成的影响

【目的】研究不同金属离子对褐黄孢链霉菌菌体生长和纳他霉素生物合成的影响。【方法】用单因素摇瓶发酵试验方法,研究不同浓度Na+,Fe2+,Mg2+,K+,Ca2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+和Co2+对褐黄孢链霉菌生长和纳他霉素生物合成的影响。【结果】在发酵培养基中添加Mg2+和Ca2+可促进褐黄孢链霉菌的菌体生长,添加Fe2+、Cu2+、Mn2+和Co2+可抑制菌体生长,而添加Na+、K+和Zn2+对菌体生长无显著影响;在发酵培养基中添加低浓度K+、Ca2+和Co2+可促进纳他霉素的生物合成,添加Na+、Fe2+、Cu2+和Zn2+抑制纳他霉素的生物合成,而添加Mg2+和Mn2+对纳他霉素的生物合成无显著影响。【结论】不同种类、不同浓度的金属离子,对褐黄孢链霉菌菌体生长和纳他霉素生物合成的影响差别较大;在培养基中添加适当浓度和种类的金属离子,有助于提高纳他霉素的产量。