H9N2亚型禽流感病毒HA检测片段阳性质粒的构建

本试验按照农业部NYT 772─2013标准构建了长度为487 bp的H9N2亚型禽流感病毒HA检测片段阳性质粒,并对该阳性质粒的特异性、敏感性和重复性进行了鉴定,获得了可用于检测H9N2亚型禽流感病毒HA片段的阳性质粒。该质粒在-20℃下即可保存,使用方便,不会污染环境,不存在散播病毒的危险。     

华东地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

为了解华东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传特点和流行规律,利用RT-PCR方法扩增华东地区2008~2013年分离的17株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因片段,进行序列测定和遗传进化分析,并对HA蛋白质的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型AIV HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.6%~99.3%和86.0%~99.5%,均属于欧亚分支。其中15株鸡源病毒属于Y280-like亚系,2株鸭源病毒属于G1-like亚系。HA裂解位点都是非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA受体结合位点149、150、191、198和234位氨基酸存在变异,尤其是234位氨基酸有14株毒株变为L,表现出人流感病毒受体结合特性。有2株毒株在145位氨基酸出现新的糖基化位点,5个毒株在218位氨基酸缺失1个糖基化位点,13个毒株在313位氨基酸增加了一个新的糖基化位点。研究结果表明华东地区近年来H9N2亚型AIV存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

H9N2禽流感病毒陕西分离株HA基因的遗传变异分析

【目的】对H9N2禽流感病毒HA基因全序列进行分析,了解H9N2禽流感分离毒株HA基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank已发表的H9N2毒株的基因序列,设计了2对H9N2禽流感病毒HA基因特异性引物,运用RT-PCR方法对XL、LF和WN分离株进行了扩增,然后将PCR产物送出进行测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行了分析。【结果】XL、LF和WN 3株H9N2分离株间HA基因的核苷酸同源性为99.7%~99.9%,推导氨基酸的同源性为99.1%~99.6%;分离株与参考毒株HA基因核苷酸的同源性为96.2%~99.0%,推导氨基酸的同源性为96.2%~98.6%。通过对3个H9N2分离株间HA基因核苷酸序列的比较,发现共有5个位点的核苷酸发生突变,其中4个位点核苷酸的改变导致相应的氨基酸发生突变。HA蛋白的7个受体结合位点比较保守,但是其在551~553位缺失了潜在的糖基化位点。【结论】3株H9N2分离株裂解位点氨基酸序列完全符合低致病性禽流感的特征RSSR↓G,但是LF裂解位点附近333位脯氨酸(Pro)突变为组氨酸(His),即非极性氨基酸向极性带正电氨基酸(碱性氨基酸)转变,裂解位点的变化可能是H9N2禽流感病毒生物学特性改变的分子基础。     

江苏H9N2亚型禽流感病毒HA和NA的遗传进化分析

为了解江苏H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用RT-PCR技术对10株从江苏不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行了扩增、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示:10株H9N2病毒间HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.3%~99.0%、93.8%~99.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%~99.9%、95.2%~100.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62~64位均存在缺失的现象,从而导致61位的糖基化位点缺失,NA基因第402位均出现了由天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的变异,8株病毒只具有6个糖基化位点。     

江苏H9N2亚型禽流感病毒HA和NA的遗传进化分析

为了解江苏H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用RT-PCR技术对10株从江苏不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行了扩增、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示:10株H9N2病毒间HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.3%⁹9.0%、93.8%99.0%、93.8%⁹9.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%99.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%⁹9.9%、95.2%99.9%、95.2%¹00.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62100.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62⁶4位均存在缺失的现象,从而导致61位的糖基化位点缺失,NA基因第402位均出现了由天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的变异,8株病毒只具有6个糖基化位点。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

H9N2亚型禽流感病毒的致病特性研究

将SS，KMI，KMIII3个禽流感病毒的感染性胚液分别中2周龄及5周龄的SPF鸡，观察其症状及病理变化。结果显示：1，3个毒株均可引起攻毒鸡体温升高，部分出现水样淡黄色稀粪，但不能致死攻毒鸡，表明3个毒株均为非高致病力毒株，2，攻毒鸡除胰腺充血出血外，其他器官不见明显的肉眼病理变化，但组织病理病理学的变化较为明显和一致，主要为：脑及脊髓充血出血，神经元变性坏死，胶质细胞增生；心肌在出血，组织变性坏列, 腺充血出血，组织坏死，3个毒株对5周龄SPF鸡的病理变化无明显差异，但KMI毒株对2周龄SPF鸡的病理损害稍大于SS株。     

广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 和 NA基因生物学特征分析

【目的】监测广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）的遗传变异和分子进化趋势,为我国 H9N2 亚型 AIV 的防控提供参考。【方法】对 2022 年广东地区 3 株 H9N2 亚型 AIV 的 HA 和 NA 基因进行扩增、克隆、测序,使用 DNAStar、PhyloSuite 软件进行序列拼接和比对,再运用 MEGA、Megalign、 NetNGlyc 1.0 Server 等软件,对其核苷酸和氨基酸序列进行遗传进化、核苷酸同源性分析,以及受体结合、蛋白活性、耐药性和糖基化等关键位点分析。【结果】系统发育树和核苷酸同源性分析结果显示,3 株分离株的 HA 和 NA 基因分别属于 h9.4.2.5 分支和 1 分支,与早期毒株的核苷酸同源性分别为 81.6%~91.7% 和 88.2%~91.2%,分别命名为 h9.4.2.5c 分支和 1.2 分支;核苷酸和氨基酸序列分析发现,HA 裂解位点为 PSRSSR ↓ GLF,受体结合位点产生 I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变,糖基化位点产生 218N 非糖基化和新增 313N 糖基化突变;NA 茎部缺失 187~195 位 9 个核苷酸（ACAGAGATA）,导致缺失 63~65 位 3 个氨基酸（TEI）;NA 红细胞结合位点产生 K/E/S368N、D369N 突变,与 NA 蛋白活性,耐药性的相关位点 E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 均未发生突变。【结论】 2022 年广东地区分离的 3 株 H9N2 亚型 AIV 已经进化成新的亚群,部分突变可能增强了对哺乳动物的适应性,且其抗原性发生改变,但尚未获得对奥司他韦和扎那米韦等抗流感病毒药物的耐药性。     

H9 N2亚型禽流感病毒HA基因体外转录及RNA标准品的初步构建

为了提高H9N2亚型禽流感病毒核酸检测结果的准确性,同时减少试验操作中的污染,对H9N2亚型禽流感病毒HA全长基因序列进行克隆及体外转录,构建用于检测H9N2亚型禽流感HA基因阳性核酸标准品。采用实时荧光定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行验证。结果表明:HA体外转录产物可以准确提供RNA片段的拷贝数并进行定性和定量分析。H9N2亚型禽流感病毒HA基因体外转录RNA可作为H9N2禽流感病毒核酸检测标准品的候选产物。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

一株H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。通过T-A连接将已加A尾的PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-Teasy vector,转化J M109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段。对目的片段进行测序,结果获得该毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的可达98%,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,该毒株属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该分离株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,其排列顺序为-PARSSRGLF-。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防AI提供了理论依据。     

H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立

【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）,并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru²⁺,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4-33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×10⁴EID₅₀,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。     

双表达H9N2禽流感病毒HA基因的假型重组杆状病毒系统的构建

以含有H9N2禽流感病毒HA基因的重组质粒pMD18-H9HA为模板,扩增HA基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将含有H9HA及gp64的基因片段克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA-H9-HA.然后将含有CMV启动子、H9HA及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质...     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器的研究

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N-′（3-二甲氨基）丙基碳化二亚胺盐酸（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒（NDV）反应;检测灵敏度达到20~100EID50。[结论]该研究为深入研究检测禽流感病毒的免疫传感器奠定了基础,为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒分离株生物学特性研究

对分离到的1株鸭源H9N2亚型禽流感病毒(NJ01株)的生物学特性进行了研究。研究结果显示:其静脉致病指数IVPI为0,脑内致病指数ICPI为0.26,血凝解脱时间NHAT为慢,血凝热稳定时间HOT为30 m in。以108.0ELD50/羽的剂量静脉感染26日龄非免疫鸭,可使40%鸭致死,且从攻毒后存活鸭1 d+2 d喉拭子中100%分离到该病毒;而以相同剂量静脉感染1月龄SPF鸡后不出现死亡,但攻毒后4~6 d的泄殖腔拭子中,均可100%再分离到该病毒。毒株血凝素基因的RT-PCR试验结果显示,与1997年香港3个分离株的同源性为94.8%~96.0%,其HA裂解位点处氨基酸序列为-RSSRG-。研究结果表明该NJ01株为低致病性禽流感病毒,属欧亚大陆分支,在SPF鸡及非免疫鸭体内均能很好地复制。