维氏气单胞菌AcrV基因的克隆与原核表达

【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度（0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2,3,4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。     

汉麻Alfin-like转录因子家族鉴定及表达分析

对汉麻Alfin-like转录因子家族进行鉴定和生物信息学分析,为Alfin-like转录因子调控汉麻生长发育及抗性奠定基础。通过利用拟南芥Alfin-like转录因子蛋白序列作为模板,利用TBtools、MEGA等生物信息学工具分析汉麻全基因组数据。在汉麻基因中共鉴定出5个CsALs基因,对其进行了理化性质分析、亚细胞定位、保守基序、基因结构、染色体定位、顺式元件、共线性分析、进化分析及聚类分析等基础分析。结果表明：鉴定的5个汉麻AL转录因子均含有DUF3594结构域（PAL结构域）和PHD手指状结构域;经理化性质分析得出,CsALs蛋白质长度在239～256 aa之间,等电点在4.97～5.31之间,亲水性为-0.809～-0.623,属于酸性亲水蛋白;CsALs基因分布在4条染色体上,亚细胞定位发现AL转录因子均定位在细胞核;上游2 000 bp启动子元件分析与光响应、胁迫响应和激素相关;根据与拟南芥、大豆、水稻、玉米、烟草等系统发育分析共分为B、E、F 3个亚族;热图聚类分析表明CsALs基因在汉麻中具有较高表达。     

羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因,使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体,经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序,构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导,纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示,ORFV116基因全长561 bp,编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa,为不稳定亲水性蛋白;无信号肽、保守结构域及跨膜结构域;含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲为主,分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）;预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示,ORFV116蛋白大小约为51 kDa,主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。     

玉米FAD2基因的生物信息学分析

脂肪酸脱氢酶（Fatty acid desaturase, FAD2）是产生不饱和脂肪酸的关键酶,在植物对多种逆境胁迫的响应中发挥重要作用。研究通过生物信息学方法对C-4作物玉米的FAD2基因及其蛋白的结构和功能作以预测和分析。分析结果表明,ZmFAD2基因含有FA-desaturase结构域,表明ZmFAD2蛋白具有脂肪酸去饱和酶的功能。ZmFAD2是定位于内质网的亲水性蛋白,系统进化树表明其与同为C-4植物的高粱和谷子亲缘关系最近。启动子顺式作用元件以及表达特性分析均表明ZmFAD2参与多种逆境胁迫的响应。研究结果为FAD2基因功能的进一步研究奠定了基础,同时为通过分子育种提高作物在逆境胁迫下的抗性提供了理论依据。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。     

胞内分枝杆菌HBHA基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

MsRCI2A/B/C基因超量表达对紫花苜蓿耐旱性的影响

【目的】分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C的表达差异并研究其抗旱功能,为苜蓿抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】采用qPCR的方法,分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在20% PEG6000溶液模拟干旱条件下表达的差异,采用农杆菌介导法获得MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因超量表达的转基因苜蓿A12、A22、B13、B19、C2和C10,观察正常生长条件（干旱胁迫0 d）下和20% PEG6000干旱胁迫6,12 d的野生型株系WT（对照）及超量表达的转基因紫花苜蓿的表型,测定超表达苜蓿和WT的叶绿素含量、相对电导率、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性及渗透调节系统（可溶性糖和脯氨酸含量）在干旱胁迫条件下的变化。【结果】在20%PEG6000模拟干旱条件下,MsRCI2A/B/C基因在紫花苜蓿叶和根中表达变化趋势相反,但3个基因在同一组织中的表达趋势相似。紫花苜蓿叶片中的MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理后均明显上调,其中MsRCI2A/C基因在干旱胁迫处理2 h时即极显著上升（P<0.01）,而MsRCI2B的表达相对缓慢,在处理8 h时极显著上升（MsRCI2A/B/C<0.01）。在根中,MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理2 h时相对表达量极显著下降（P<0.01）。在正常生长条件（干旱胁迫0 d）下,6个转基因苜蓿叶绿素含量、相对电导率和MDA含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量与野生型苜蓿（WT）相比无明显差异,但转基因苜蓿SOD、POD、CAT活性明显高于WT（P<0.05）,其中转MsRCI2B/C基因苜蓿叶片中的SOD活性及叶和根中POD活性是WT的1.97~2.27倍。转基因株系A12、A22、B13、B19、C2和C10与野生型苜蓿(WT)同时进行20%PEG6000模拟干旱胁迫处理12 d后,各转基因株系的叶绿素含量极显著高于WT (P<0.01),为WT的3.00~3.46倍,而相对电导率和丙二醛含量则极显著下降了73%和55%。转基因苜蓿叶和根中的可溶性糖和脯氨酸含量及SOD、POD和CAT活性均显著升高（P<0.05）,其中MsRCI2A/C转基因苜蓿叶和根中的CAT活性是WT的2~3倍,MsRCI2B/C转基因苜蓿叶和根中的脯氨酸含量是WT的3倍。【结论】MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的过表达可以增强苜蓿的耐旱性。     

分蘖洋葱和普通洋葱营养品质的比较

【目的】对分蘖洋葱和普通洋葱的营养品质进行对比分析,为分蘖洋葱营养价值的进一步研究提供科学依据。【方法】测定紫皮和黄皮普通洋葱及褐皮和黄皮分蘖洋葱不同部位的基本营养成分和特殊风味物质含量,比较种类和品种间各营养成分含量的差异。【结果】分蘖洋葱干物质质量分数为9.37%~19.20%,可溶性糖含量为89.34~132.99mg/g,可溶性蛋白含量为1.54~2.46 mg/g,游离氨基酸含量为1.56~2.85μg/g,丙酮酸浓度为62.31~123.67μmol/mL,黄酮类化合物含量为2 193.4~2 648.2mg/kg;基本营养成分和丙酮酸含量均为内层鳞茎高于外层鳞茎,黄酮类化合物含量为外层鳞茎高于内层鳞茎;褐皮分蘖洋葱除可溶性糖和黄酮类化合物外,其他营养物质含量均低于黄皮分蘖洋葱。【结论】分蘖洋葱基本营养成分和特殊风味物质含量均显著高于普通洋葱;相同类型不同皮色间在营养成分含量上存在差异,且不同成分间的差异性不同;从各种营养物质的分布看,除黄酮类化合物外均表现为内层鳞茎高于外层鳞茎。     

苋菜AmSPL基因家族转录组鉴定及表达分析

为明确SPL(Squamosa Promoter Binding Protein Like)在苋菜中的功能,基于‘全红’苋菜转录组数据库筛选获得17个SPL家族成员,并进行生物信息学分析预测。结果表明,17 个AmSPL蛋白分别由186~777 个氨基酸组成,相对分子量从20.53~88.27 ku。构建AmSPL与拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)16个AtSPL成员系统进化树,并根据AtSPLs基因家族的分类标准将AmSPL成员分为6组。实时荧光定量PCR分析表明,在黑暗条件下,AmSPLs的表达量均高于蓝光下,推测AmSPLs的表达可能通过某种方式受到蓝光的负调控。预测分析其中的8 个AmSPL可能是miR156的靶基因。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

苋菜AtrADH2基因克隆及表达分析

ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以'苏苋1号'苏苋2号'苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371).结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为...     

黄芽白与红菜薹杂种后代的细胞遗传学特征

将白菜型油菜不同栽培种‘红菜薹’和‘黄芽白’进行正反交获得杂种一代,再经过多代自交获得高世代杂种。观察杂种后代形态学特征(叶型、株高、分枝数等）、育性特征（花粉育性、自交结实率）和花粉母细胞减数分裂染色体行为特征。结果表明经过多代自交,杂种后代各性状趋于稳定,正反交杂种形态有较大差异,而高世代杂种与杂种一代相比,形态没有明显变化。杂种后代花粉育性和自交结实率都比较高,花粉可育率均达到90%以上,但与双亲相比仍然稍差。杂种后代花粉母细胞减数分裂比较正常,但仍有少数细胞出现异常染色体行为。杂种后代减数分裂终变期染色体联会主要以形成环状和棒状的二价体为主,但也形成四价体等其他染色体构型。杂种后代中平均形成二价体的数目在6.7～8.2,最多全部20条染色体形成10个二价体,其中形成环状二价体和棒状二价体的比例相差不大。除了形成二价体外,部分花粉母细胞还形成少数四价体。与亲本相比,杂种后代染色体联会出现较多的非同源联会,平均每个细胞形成二价体的数目比亲本少,而形成四价体的数目比亲本多。在减数分裂后期Ⅰ,同源染色体分开并移向细胞两极,减数分裂后期Ⅱ,染色单体分开最终形成四分体。在此过程中,绝大多细胞染色体行为正常,但有个别细胞出现后期Ⅰ染色体不均等分离,有些细胞同源染色体分开时形成染色体桥;有些细胞在减数分裂Ⅱ中期和后期出现落后染色体。此杂种后代减数分裂过程较正常,探明杂种后代的减数分裂特征可为白菜型油菜杂交育种提供理论依据。     

沙棘柠条的生物量及立地因子分析

调查结果表明,黄土高原地区同龄林的沙棘生物量为柠条的3.76～9.64倍.生长率沙棘在9～10龄后开始下降,柠条在5～6龄后开始下降.据偏相关分析,坡向、坡位和土壤类型是影响沙棘、柠条的主要立地因子.0～35cm土层沙棘根系主要分布区,约占根系总干重的91.72%.0～100cm土层为柠条根系主要分布区,占0～150cm土层总根系的99.31%.沙棘根瘤在6～9龄时最多;柠条根瘤主要分布于0～50cm土层,林地枯落物积累量:沙棘为7.45～17.25t/ha,柠条为1.8～2.6t/ha.     

小麦属分类

小麦属的分类系统建议采用:(1)保持小麦属的传统属界;(2)在属内根据特化的染色体组型和生殖隔离认定有5个种;(3)根据形态特征、栽培类型、染色体组亚型分化及地理分布等将大多数传统形态种降为亚种,共确定24个亚种;(4)废弃原有的一些亚种;(5)保持原有变种.     

甜樱桃(Prunus avium L.)LEAFY基因的克隆及表达模式分析

为探索LEAFY基因在甜樱桃花芽分化过程中的表达及作用,以甜樱桃(Prunus avium)‘红蜜'(Hongmi)为试材,利用同源克隆和RACE方法克隆甜樱桃中LEAFY同源基因cDNA全序列,对其序列进行分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对该基因在花芽分化过程中的表达量进行鉴定。结果显示:在甜樱桃中具有3中不同长度类型,分别为1 532、1 498和1 410bp,主要由3′UTR区长度不同所导致,开放阅读框长1 233bp,编码410个氨基酸,推测蛋白分子量约为45.6ku,等电点约为6.88。结构预测NCBI序列比对发现其氨基酸序列与其他植物中同源基因相似性均在70%以上,故命名为PaLEAFY。qRT-PCR分析发现,在果实成熟至成熟后33d,PaLEAFY在花芽中的表达量由高变低,果实成熟后45d,PaLEAFY表达量开始急剧升高并维持至69d,69d之后表达量再次升高,并于果实成熟后99d达到最高。此外,PaLEAFY在甜樱桃花的柱头中的表达量最高,其次是花瓣、雄蕊和花萼,在甜樱桃的茎和叶中的表达量非常低。说明PaLEAFY参与甜樱桃花芽分化及花发育过程。     

玉米与龙葵间作模式对植物生长及Cd富集特征的影响

为探究最优的间作修复模式,通过田间小区试验,以玉米和超富集植物龙葵为研究对象,设置单作玉米（CK1）、单作龙葵（CK2）、宽窄行玉米宽行间作单行龙葵（T1）、宽窄行玉米宽行间作双行交错龙葵（T2）、等行距单行玉米间作单行龙葵（T3）、等行距单行玉米间作双行交错龙葵（T4）、等4行距玉米间作等4行距龙葵（T5）7种种植模式,研究不同模式下玉米和龙葵各器官生物量、土地当量比、Cd含量、富集系数和转运系数、总Cd提取量、根际土壤pH和有效态Cd含量的变化。结果显示,5种间作模式的土地当量比均大于1。与CK1相比,T3间作模式玉米产量增加15.6%,T1、T4、T5间作模式玉米产量降幅小于10%,T2间作模式玉米产量减少16.8%;与CK2相比,5种间作模式龙葵单株总生物量没有显著变化。5种间作模式没有显著改变玉米和龙葵各部位的Cd含量,以及生物富集系数和转运系数,但却显著提高了单位面积总Cd提取量,其中T4间作模式最高。除T5外,其他4种间作模式均显著降低了龙葵和玉米根际土壤pH,提高了龙葵根际土壤Cd有效态含量,却降低了玉米根际土壤Cd有效态含量。这表明玉米与龙葵表现为种间生长促进,T1、T3、T4、T5 4种间作模式不仅可以保障玉米稳产,而且能显著提高修复效率,实现边生产边修复的目的,其中T4间作模式最优。另外,沈阳地区龙葵种子在湖南表现出不适应性,建议选用当地龙葵进行间作修复。     

基于转录组的苋菜LBD基因家族鉴定及蓝光下的表达分析

为了解苋菜LBD基因家族,本研究利用转录组数据筛选和鉴定苋菜LBD基因家族成员,并命名为AtrLBD。结果表明:1)从‘全红’苋菜转录组中共鉴定得到16个AtrLBD基因,均为不稳定蛋白,氨基酸长度在91～351aa,相对分子质量为9.396～38.250ku;二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主;亚细胞定位预测,AtrLBD定位在细胞核、叶绿体和线粒体;MEME分析结果表明,16个AtrLBD共有10个保守氨基酸序列;2)系统进化树显示,16个AtrLBD与拟南芥LBD蛋白分为第一类(ClassⅠ)和第二类(ClassⅡ)2大类,细分为Class Ia、Ib、Ic、Id、Ie和Class IIa、IIb等7个亚类;miRNA预测结果显示,有4个AtrLBD是miRNA靶基因;3)qRT-PCR结果显示,除AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD10和AtrLBD16以外,AtrLBD均受到蓝光的诱导表达。上述结果为深入研究苋菜LBD基因家族的功能及进化分析奠定了基础。