锦鲤疱疹病毒双重PCR检测方法的研究

为了快速确诊锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV),本试验建立了KHV双重PCR检测方法。根据锦鲤疱疹病毒的SphⅠ-5基因和胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(thymidine kinase,TK)基因设计特异性引物,优化反应条件,建立了KHV双重PCR检测方法。结果表明,建立的方法简单、灵敏、准确,一个反应体系可同时扩增292 bp和410 bp两个基因片段,可有效用于KHV的检测。     

锦鲤疱疹病毒双基因检测方法的研究

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)双基因检测方法,本研究根据KHV聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)的保守序列设计2对引物,建立两基因同时检测的PCR方法.结果表明,利用双基因同时检测KHV,可以同时特异扩增出570 bp和155 bp片段,而与鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼疱疹病毒无扩增反应.而且所建立的双基因检测方法对临床样品的检测结果与单一PCR方法比较符合率为100％.为进一步研究KHV以及诊断方法奠定了基础.     

锦鲤疱疹病毒的PCR鉴定

根据锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)的基因序列合成了2对引物,对送检的发病锦鲤样品提取DNA进行PCR检测,分别扩增出KHV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(thymidine kinase,TK)409 bp和AF411803基因序列484 bp的条带,对484 bp的PCR扩增产物经限制性内切酶TaqⅠ和AluⅠ酶切,分别得到200 bp/284 bp和185 bp/299 bp的片段,484 bp的PCR扩增产物的测序结果与GenBank上已发表的KHV序列一致。结果显示发病锦鲤为KHV阳性。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列，设计了与PRV的gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRVDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重PCR扩增，均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明，多重PCR可以检测到106Pg三基因缺失疫苗毒或756PgPRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明，以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增，均无任何条带。     

天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

2017年6月,天津市滨海新区、北辰区等地一些养殖场的锦鲤出现急性死亡,发病3 d后死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、内脏出血等临床症状,初步诊断为锦鲤疱疹病毒病。针对锦鲤疱疹病毒(KHV/CyHV)的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因设计特异性引物,建立PCR方法进行KHV基因检测。结果显示:死亡疑似病例的KHV检测阳性;测序获得的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段长度分别为409、300、317、939和156bp,与CyHV-3-J2病毒株基因序列同源性为97.6%～100%。系统发育树分析显示,其与CyHV-3亲缘关系最近,自然聚为一支,最终确定为CyHV-3型。以上研究为锦鲤疱疹病毒病的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。     

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和精氨酸支原体多重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登陆的绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MmC)和精氨酸支原体(M.arg)的相关基因序列,分别设计了扩增MO hsp70基因、MmC hsp70基因和M.arg ADI基因片段的特异性引物,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了MO、MmC和M.arg的多重PCR检测方法。特异性试验结果显示:该方法能同时扩增出MO 703bp、MmC 385bp和M.arg223bp的特异性目的片段,而对其他病原的DNA扩增为阴性。敏感性试验结果显示:该方法对这3种支原体的最低核酸检出量均为10pg。55份临床样品检测结果表明:三重PCR检测结果与分离培养诊断方法一致,均能检测出样品中的病原菌。本试验建立的多重PCR方法能为MO、MmC和M.arg的感染提供正确快速诊断方法。     

多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因

根据对已报道的PCR检测方法灵敏性评价,以常用KHV病毒PCR检测的目的基因KHVSphI片段(AY568590)、KHV5/9(AF411803)和KHVTK基因(AJ535112)作为靶基因,设计并选择3对特异性引物建立的多重PCR检测体系用于KHV病毒多基因的检测。本研究建立的多重PCR体系具有较高的特异性,能够特异性扩增出KHVSphI片段290bp、KHV5/9片段484bp和KHVTK基因片段409bp,对锦鲤和鲤鱼的另外一种病毒性病原鲤春毒血症病毒检测结果为阴性。多重KHV病毒PCR体系检测KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段单一模板的检测下限分别为:10fg、100fg和100fg,在相同模板浓度的情况下,KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段同时被检出的检测下限为100fg。对KHV病毒感染组织的检测结果表明,多重KHV病毒PCR检测结果与常规PCR检测结果基本吻合,在多重PCR检测体系中KHVTK基因片段检测的灵敏度高于检验检疫行业标准方法。结果表明,多重KHV病毒PCR检测方法能够快速、准确和灵敏地检测KHV病毒基因。     

检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。     

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定

本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHV ORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj.基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近.将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%.表明本研究在国内首次分离到KHV.     

山羊痘病毒疫苗株ORF64～ORF67的分子特征

为构建胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因缺失活载体疫苗，对山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）疫苗株（AV41）ORF64-ORF67进行了克隆和序列分析。结果表明：在全长3460bp的DNA序列中，包含4个完整的开放阅读框（Open reading flame，ORF）。ORF64核苷酸序列全长396bp，编码病毒膜蛋白；ORF65核苷酸序列全长444bp，ORF64和ORF65有44个碱基重叠。ORF66核苷酸序列全长534bp，编码胸苷激酶，具有保守的ATP结合位点和细胞中TK特征序列。ORF67核苷酸序列全长594bp，编码宿主范围相关蛋白。ORF64-ORF66在脊索动物痘病毒亚科中是完全保守的。与参考的国外GPV进行序列比较，ORF64～ORF67有一些差异，如突变和插入等。同源性分析显示：与羊痘病毒属比较，核苷酸和氨基酸同源性均较高（94．7％～100％）。我国的GPV不同毒株TK同源性为100％。与脊索动物痘病毒亚科中其他成员同源性差异较大（17．3％～65．2％）。将GPV AV41TK与鸡、小鼠和人类的TK氨基酸序列进行比较，分析GPV AV41TK进化关系表明，GPVTK基因在进化上可能起源于宿主细胞的TK1基因。本研究结果显示，在分子水平上我国GPV AV41与国外毒株存在差异，推测可能是GPV AV41疫苗株在致弱过程中发生一定程度的变异。     

Generation of monoclonal antibodies specific for ORF68 of koi herpesvirus

Outbreaks of koi herpesvirus (KHV) infection in carp are still a serious problem worldwide. KHV is closely related to other two cyprinid herpesviruses, pox herpesvirus (CHV) and haematopoietic necrosis herpesvirus (CyHV-2) in goldfish. In this study, two major KHV antigenic proteins (ORF62 and ORF68) were identified by immunoscreening using a KHV-specific polyclonal antibody, and then monoclonal antibodies were generated for immunodiagnostic studies. After screening hybridoma cells, one mAb against ORF68 (mAb-7C6) was obtained but no mAbs against ORF62. mAb-7C6 specifically reacted with a lysate of KHV-infected koi fin cells (KF-1 cells) but not with lysates of CHV- or CyHV-2-infected KF-1 cells in an immuno-blotting analysis. Similar results were shown in the following tests: (1) a indirect fluorescent antibody test using infected KF-1 cells and (2) an immunohistochemical investigation by fast red stain (infected liver) or FITC detection (infected spleen). These results suggested that mAb-7C6 specifically reacts with KHV ORF68 protein.     

Detection of Foot and Mouth Disease and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viral Genes Using Microarray Chip

Two viral pathogens, namely, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and foot and mouth disease virus (FMDV), were selected as models for multiple pathogen detection in a cDNA microarray. Two signature regions selected from ORF2 (around 500 bp) and ORF5 (around 600 bp) of PRRVS (America serotype), and one signature region from structural genes VP1 (around 500 bp) of FMDV type O were designed and spotted on a nylon membrane. For PCR sensitivity study, the cloned FMDV–VP1 template could be diluted to near one copy and its PCR product was still detectable in gel electrophoresis. In the microarray detection, the labelling FMDV probes (3 mg/ml) could be diluted 320 times and still maintained a visible colour when hybridized with the chip. Using the mixing primers, the microarray chip demonstrated rapid and accurate detection of the specific genes. To our knowledge, this preliminary study is the first example reported applying the long signature sequences to the multiple pathogen detection in cDNA microarray.     

鸽痘病毒TK基因的扩增、克隆及序列分析

根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1 、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大小的目的片段。对PCR产物用限制性内切酶NcoI进行酶切分析,结果酶切产物得到两条条带,大小分别为628 bp和732 bp,与3个已发表的TK基因分析结果一致。分别将6个禽痘病毒TK基因克隆至pGEM-T Easy载体中,重组质粒经PCR和酶切鉴定后,进行测序。结果表明,本试验获得的TK基因长1 360 bp,存在一个NcoI酶切位点,两个XbaI酶切位点。序列分析表明:PPVD和PPVX同VVG和VVJ的TK基因同源性为100％;在TK基因的编码区内PPVY有一个碱基与其它毒株不同;各毒株TK基因的侧翼都存在15 bp的正向重复序列和8 bp的倒转重复序列;PPVD、PPVX和PPVZ虽然来源于同一个毒株,但TK基因存在差异。     

FRRSV和PCV-2双重PCR检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和猪圆环病毒2型(PCV-2)(AF381175)的ORF2基因保守序列,设计合成了两对特异性引物。用这两对引物,通过优化的PCR条件,对PRRSV阳性毒株反转录后的cDNA模板和PCV-2毒株的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到两条与试验设计相符的432bp(PRRSV)和630bp(PCV-2)特异性条带,建立了同时检测PRRSV和PCV-2的双重PCR方法。并用此方法对在安徽省不同地区所采集的72头份病猪的淋巴结、肺、肝、脾、肾等组织进行检测,证明建立的PCR方法可用于临床诊断。     

Detection and sequence analysis of DNA polymerase and major envelope protein genes in koi herpesviruses derived from Cyprinus carpio in Gunma prefecture, Japan

Koi herpesvirus (KHV), which is believed to be an emerging virus, causes fatal diseases in carps. Since the 1990s, the presence of KHV has been confirmed in several countries. In Japan, from 2003 to 2004, large outbreaks of KHV infection in farmed carps resulted in the death of numerous fishes. From April to May 2004, we collected 43 dead or dying carps exhibiting typical symptoms of KHV infection in Gunma prefecture. To conduct a molecular epidemiologic study of KHV in our prefecture, we amplified DNA polymerase and the major envelope protein genes of KHV derived from carp gills using newly designed primers. We also performed sequence analysis of both genes of KHV. Sensitivity of our PCR method for amplification of DNA polymerase and the major envelope protein genes of KHV was 3 x 10(2) (100 fg) and 3 x 10(3) (1000 fg) copies of KHV genome, respectively. We detected both DNA polymerase and major envelope protein genes in 37 of 43 carps (86%). No mutation was found in both the genes sequenced from 11 strains, which included two foreign strains and one domestic strain. The results suggested that KHV strains derived from carps in our prefecture were closely related genetically to the other KHV strains.