高原习服黄牛脑组织不同部位SLC25A6 mRNA绝对定量分析

为研究SLC25A6 mRNA在高原习服黄牛脑组织中的表达量对能量利用的影响,建立用于SLC25A6基因绝对定量的标准曲线;标准曲线扩增效率为E=104.9%,回归系数r值为-0.996,斜率为-3.210,溶解曲线峰值单一;绝对定量检测值表明,高原习服黄牛脑组织各部位SLC25A6 mRNA表达量总体差异有统计学意义,SLC25A6 mRNA检测值从高至低依次为小脑、海马、枕叶、额叶、颞叶、顶叶,小脑SLC25A6基因表达量显著高于其他各组织;顶叶表达量最低,小脑表达量为顶叶表达量的2.79倍;额叶、颞叶、顶叶之间差异,枕叶、海马之间差异均无统计学意义。结果表明,高原习服黄牛脑组织中小脑耗能强度可能最大,细胞活动旺盛;相反顶叶耗能强度最低。     

牦牛MT-3基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对牦牛金属硫蛋白3基因进行生物信息学分析,从而预测MT-3基因编码产物的理化性质以及功能结构域,并构建MT-3同源基因的系统进化树。结果表明,牦牛MT-3基因含有1个513 bp的ORF,编码170个氨基酸。MT-3蛋白分子质量约为17 556.37 Da,理论等电点为5.68。MT-3编码产物的二级结构主要以β折叠和无规则卷曲为主,推测是非酶类蛋白质。MT-3具有神经生长抑制活性,通过清除自由基和NO,从而起到保护脑细胞的作用。     

牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据,对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA,并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列（GenBank登录号：DV874786.1）,使用Primer3.0在线软件设计特异性引物,运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树;利用PyMol软件修饰并输出三维结构;使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位;使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS区573 bp(GenBank登录号：KF669898),碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变,同源性为99.3%,这个突变未导致氨基酸序列的改变,4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7,分子量约为21.5 kD,理论等电点（pI）为6.32,消光系数为24075,不稳定系数为48.43,疏水指数为83.63,平均亲水性为-0.301,属不稳定可溶性酸性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,其中α-螺旋占64.21%,无规卷曲占35.79%,属全α类蛋白质。三级结构是一个呈“three-over-three”三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中,主要在细胞质,推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致,说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区,并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析,得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质,在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。     

甘南牦牛H-FABP基因CDS区多态性及生物信息学分析

应用PCR产物混合样本DNA池法检测甘南牦牛心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因CDS区多态性,并应用生物信息学方法分析甘南牦牛H-FABP蛋白质特性.结果表明:甘南牦牛H-FABP基因CDS区序列与九龙牦牛相同,而与普通牛对比在第3外显子存在*76G>A的同义突变;甘南牦牛H-FABP氨基酸序列没有明显的疏水性区域,也未形成跨膜螺旋区及信号肽,推测其主要在细胞质中发挥生物学作用;甘南牦牛H-FABP基因编码产物二级结构是以α-螺旋和β-折叠为主的mixed型;氨基酸序列与普通牛、山羊、马、人、小鼠、大鼠、鸡、草雀及绿鸭9个物种间同源性较高,与其实际亲缘关系远近一致.     

牦牛JHDM2A基因的克隆测序及其生物信息学分析

利用RT-PCR克隆技术对牦牛JHDM2A基因进行cDNA克隆测序,并用生物信息学软件分析该基因的编码区序列、蛋白结构及进化关系。结果表明:①牦牛JHDM2A基因cDNA序列大小为4 605bp,其中CDS区序列3 969bp,编码氨基酸1 323个。牦牛JHDM2A基因与人、小鼠、褐鼠、原鸡等物种该基因序列比对,一致性分别为90.3%、86.9%、86.3%、69.9%,在物种间具有较高的一致性。②牦牛的JHDM2A蛋白存在JMJC结构域,属于JMJD家族的一员,该蛋白是一种弱碱性、无跨膜结构的游离蛋白,不定位于细胞的任何部位,进化速度慢、保守性强。以上结果为进一步从分子水平上了解牦牛JHDM2A基因和JHDM2A蛋白的结构、功能提供了理论基础。     

甘南牦牛CYGB基因的克隆及生物信息学分析

【目的】探讨甘南牦牛CYGB基因的分子结构特征及生理功能。【方法】提取甘南牦牛血样基因组DNA,以其为模板PCR分段扩增后拼接得到CYGB基因,测序后进行生物信息学分析。【结果】克隆出甘南牦牛CYGB基因,其长度为8 484bp,含有4个外显子和3个内含子,外显子长度分别为143,232,164和34bp,内含子长度分别为5 175,280和2 379bp,可编码190个氨基酸残基,氨基酸编码存在明显的密码子偏倚现象。与普通牛相比较,甘南牦牛CYGB基因存在73处核苷酸变异位点,其中2处发生在外显子2区域,氨基酸序列未发生改变;71处发生在内含子区域。甘南牦牛CYGB拥有"three-over-three"类型的螺旋"三明治"折叠结构。系统发育树分析表明,甘南牦牛CYGB与黄牛、绵羊等物种之间存在较高的同源性。【结论】成功克隆了甘南牦牛CYGB基因,为进一步研究牦牛CYGB的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

绵羊LDHAL6A基因的电子克隆与生物信息学预测

以人LDHAL6A基因的cDNA序列为探针,利用生物信息学方法,对绵羊LDHAL6A基因进行了电子克隆,并对推导出LDHAL6A基因编码的蛋白结构与性质进行了预测。结果表明：绵羊LDHAL6A基因的cDNA序列全长为1798bp,包括999 bp的编码区和149bp的5ˊ非翻译区（5ˊUTR）、650 bp的3ˊ非翻译区序列（3ˊUTR）,编码合成332个氨基酸的多肽;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于内质网上;无规则卷曲、琢-螺旋是绵羊LDHAL6A蛋白主要的二级结构元件。绵羊LDHAL6A基因编码蛋白可能在精子生成过程中起重要作用。     

牛SLC13家族基因编码蛋白的生物信息学分析

为研究牛溶质载体13(SLC13)基因编码蛋白的结构和功能,运用生物信息学软件对牛SLC13蛋白的理化性质、疏水性、二级结构及三级结构、序列保守基序、亚细胞定位、跨膜区进行分析,预测其蛋白质互作网络并构建不同物种SLC13基因家族编码蛋白的系统发育树。结果表明,牛SLC13蛋白的氨基酸数介于520～626个,亮氨酸含量最高,组氨酸含量最低,分子质量介于57.80～68.96 ku,其编码蛋白均为疏水性蛋白,除SLC13A2蛋白外的4个编码蛋白均为稳定蛋白。牛SLC13蛋白的二级结构主要由α-螺旋、β-转角以及无规卷曲组成,外显子数目介于11～16,除SLC13A3基因编码蛋白无Motif 10、SLC13A5基因编码蛋白无Motif 8外,其他编码蛋白序列均存在Motif 1—10,SLC13蛋白亚细胞定位于质膜、内质网和线粒体,SLC13A3蛋白在高尔基体中有少量分布。牛SLC13蛋白均为多次跨膜螺旋的内在膜蛋白,其以不同形式在生物学层面和分子功能层面发挥功能。系统进化分析发现,14个物种的SLC13A1、SLC13A4蛋白处于同一个较大分支,SLC13A2、SLC13A3和SLC13A5处于另一个较大分支,普通牛均与瘤牛、水牛、牦牛亲缘关系最近。     

奶牛PSME3基因CDS区克隆、表达及生物信息学分析

旨在探讨蛋白酶体激活亚基3(proteasome activator subunit 3,PSME3)基因的序列特征,及其在奶牛乳腺组织中的表达和功能。采用qPCR法检测PSME3基因在健康奶牛和大肠杆菌(Escherichia coli)诱导的乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量;通过基因克隆与测序方法获得奶牛PSME3基因的编码区(CDS)全长序列,并利用生物信息学方法分析PSME3基因及其编码的蛋白质的结构与功能。结果表明,与健康奶牛相比,PSME3基因在E.coli诱导的乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达显著上调;PSME3基因的CDS区全长为765 bp,编码1条由254个氨基酸组成的较稳定且无跨膜结构域的非分泌型蛋白质,含有PA28α和PA28β结构域,主要在细胞核中发挥作用。PSME3可通过核转位因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路参与调节乳腺细胞的质膜合成、细胞周期、增殖凋亡以及奶牛乳腺组织的免疫反应等多种生物学过程。     

牦牛POMC基因的克隆及生物信息学分析

为探讨工布江达牦牛POMC基因的分子结构特征,通过分子克隆技术获得工布江达牦牛POMC基因全序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等进行预测与分析。结果表明,工布江达牦牛POMC基因包含1个798bp的开放阅读框,编码265个氨基酸,其编码蛋白属于亲水性蛋白,具有明显的信号肽,二级结构主要以无规卷曲和α-螺旋为主。以POMC基因构建的邻接系统发育树表明,工布江达牦牛POMC与野牦牛、普通黄牛、水牛和羊等品种的POMC遗传距离较近,具有高度同源性。     

基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白

【目的】从蛋白水平阐明牦牛抗寒性能机理,并进一步从营养学角度提高其代谢性能,为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供科学依据。【方法】应用TMT蛋白组学技术对寒冷季节（1月）和温暖季节（8月）的牦牛抗冻蛋白进行挖掘,并对鉴定到的牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO功能富集、KEGG信号通路注释、蛋白相互作用等生物信息学分析。【结果】从牦牛耳组织中共鉴定获得21856个肽段（Peptide）,其中特有肽段（Unique peptide）序列为18452个,定量获得4519个蛋白,最终筛选出144个差异蛋白,其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。144个牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位到7个条目上,分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋白18个、细胞骨架蛋白1个和溶酶体蛋白1个;共鉴定到194个结构域。GO功能富集分析结果显示,生物过程主要富集到细胞过程蛋白79个、代谢过程蛋白70个和生物调控蛋白42个等,分子功能主要富集到结合功能蛋白75个和催化活性蛋白64个等,细胞组分主要富集到细胞部分蛋白89个和细胞蛋白89个等。144个牦牛抗冻差异蛋白在KEGG数据库中注释到205条KEGG信号通路,主要涉及核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作用、氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等通路。牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析发现L8IHE5的关联度最高,且冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）和HSP70结合蛋白在蛋白相互作用网络中具有更多的相互作用关系。【结论】基于TMT蛋白组学对牦牛抗冻差异蛋白进行挖掘,结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白89个,下调蛋白55个）,其中CIRP和HSP70在冷应激条件下呈上调趋势,能促使牦牛肌体适应低温环境,可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。     

牦牛解偶联蛋白 3基因的克隆测序和肌肉表达谱

为了比较高原牦牛和低海拔地区黄牛解偶联蛋白-3(UCP3)基因序列及其在骨骼肌中的表达水平,采用RT-PCR方法从牦牛背最长肌中克隆UCP3基因,所获得的cDNA序列编码区及推导的氨基酸序列与GenBank中黄牛相应序列相比相似度均为99.04%,编码区有9个碱基差异,并导致3个氨基酸的改变。实时定量RT-PCR分析显示,牦牛背最长肌中UCP2 mRNA水平显著高于黄牛,而背最长肌中UCP3 mRNA及股二头肌中UCP2、UCP3 mRNA水平均显著低于黄牛。另外,牦牛背最长肌中Mn-SOD活力显著高于黄牛。这些特征可能与牦牛肌肉在低氧环境中的能量代谢有关。     

天祝白牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

利用PCR技术从天祝白牦牛基因组DNA中获得乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因序列,将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体进行测序后,与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白序列进行比对和进化树分析.结果表明:克隆获得了含天祝白牦牛乳铁蛋白第二外显子的DNA序列,共778 bp,其中Lfcin基因编码区长75 bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在9个碱基的变异,其中Lfcin基因编码区内有1个变异,为同义突变;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性.     

牦牛PRKAG3基因部分序列多态性分析

采用PCR-SSCP技术,对甘南牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛的PRKAG3基因第3、第9内含子的多态性进行检测.结果表明,牦牛PRKAG3基因在第3、第9内含子中均存在多态位点,2个位点分别存在AA、AB和EE、EF基因型.其中,A和E为优势等位基因,2个位点在3个牦牛群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态.独立性检验结果表明,在1806 bp处天祝白牦牛与甘南牦牛之间差异显著(P＜0.05),大通牦牛与甘南牦牛、天祝白牦牛之间差异不显著(P＞0.05);在4487 bp处大通牦牛和天祝白牦牛、甘南牦牛之间差异极显著(P＜0.01),天祝白牦牛与甘南牦牛之间差异不显著(P＞0.05).     

新疆3个不同品种牛SLC11A1基因启动子克隆及序列分析

[目的]溶质性载体蛋白家族成员1(SLC11A1)基因是一个主要的自然抗性候选基因,与多种胞内寄生病原菌的抵抗作用相关,研究克隆新疆褐牛、荷斯坦牛和西门塔尔牛SLC11 A1基因启动子序列,分析启动子序列差异,为奶牛抗病育种提供辅助选择的分子标记.[方法]分别采集新疆3个品种牛全血,提取基因组DNA,PCR扩增5'端启动子区,测序.利用生物信息学软件CpGplot、RepeatMasker、TFSEARCH、WWW SignalScan及双荧光素酶检测系统对获得序列进行分析.[结果]获得SLC11A1基因启动子片段1 463 bp,且具有启动子活性,未发现CpG岛的存在.新疆3个品种牛间SLC11A1基因启动子序列未出现差异,但与美国安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在4处差异.启动子区预测到SP1,NF1,RelA-p65,GKLF,CPBP等12个转录因子结合位点,并发现1个增强子区域(-734～-740),该序列存在两处短散的重复元件BOV-tA2、MIR3,以及重复DNA元件Charlie8.[结论]得到新疆地区3个品种牛SLC11A1基因启动子序列,并与安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在差异,为进一步研究SLC11A1基因多态性影响机体对胞内感染菌的抗性研究提供理论依据.     

"大通牦牛"Lfcin基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆“大通牦牛”Lfcin基因,为将该基因应用于饲料工业和养殖业提供依据。[方法]利用PCR技术从“大通牦牛”基因组DNA中获得乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将“大通牦牛”与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。[结果]克隆获得了含“大通牦牛”LF（Lactoferrin）第二外显子的DNA序列,共778bp,其中Lfcin基因编码区长75bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;进化树分析表明Lfcin进化树符合物种进化规律。[结论]该研究为Lfcin基因在原核或真核细胞中的表达研究以及进一步研究Lfcin蛋白的生活活性奠定了基础。     

大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析

采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,对大通牦牛TLR2基因CDS区的SNP位点进行筛选,估算各SNP位点等位基因频率,并通过生物信息学软件预测突变对TLR2 mRNA和蛋白质结构的影响。结果表明,大通牦牛TLR2基因CDS区存在2个SNP位点,分别为G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A,其中G⁶⁷⁷A为错义突变,导致半胱氨酸(Cys)转变为酪氨酸(Tyr)。生物信息学分析结果表明,G⁶⁷⁷A和G¹⁵⁸⁷A位点均降低了mRNA二级结构的稳定性,且蛋白二、三级结构组成也发生了改变。     

牦牛源产气荚膜梭菌β2基因的原核表达及生物信息学分析

为了原核表达一株牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1的β2基因及了解其编码蛋白的生物信息。首先利用PCR扩增技术、基因克隆技术构建原核表达质粒并通过高通量测序、双酶切技术、SDS-PAGE检测和Western blotting方法对表达情况进行鉴定,其次利用生物信息学分析的方法对β2毒素蛋白的一级结构、二级结构、蛋白特殊区域、三级结构及B细胞线性抗原表位等多方面进行预测分析。原核表达结果显示：牦牛源产气荚膜梭菌β2基因在温度为37℃,IPTG浓度为1.5 mmoL/L,培养时间为8 h～10 h的条件下可得到大小约为28KD的可溶于细胞质的不含信号肽的目的蛋白。生物信息学分析结果显示：牦牛源产气荚膜梭菌β2基因大小为798 bp,共编码265个氨基酸,与印度的产气荚膜梭(FR687302.1)的β2毒素基因相似性最高;其分子式为C₁₃₉₂H₂₁₃₆N₃₅₆O₄₁₈S₁₁,分子量为30.9 ku,pI=6.04,负电荷(Asp+Glu)残基总数36个,正电荷(Arg+Lys)残基...     

甘南牦牛NGB基因的克隆及序列分析

【目的】对甘南牦牛NGB基因进行克隆和序列分析,同时探讨NGB的生理功能。【方法】采用TA克隆法克隆甘南牦牛NGB基因,运用多种软件对其基因序列及编码产物的结构、功能进行了生物信息学分析。【结果】甘南牦牛NGB基因全长3 844bp,包括4个外显子和3个内含子,其内含子中存在2个反向重复序列和1个正向重复序列;牦牛NGBCDs区全长456bp,其编码产物是由151个氨基酸残基组成的可溶性蛋白质,分子质量约为16 876.36u,理论等电点为4.86,推测NGB编码产物可能在牦牛物质运输和结合、能量代谢等过程中发挥着重要作用;系统发育树分析表明,甘南牦牛NGB与牛、藏羚羊等物种之间存在较高的同源性。【结论】甘南牦牛NGB基因的成功克隆,为进一步研究牦牛NGB的遗传特性和生理功能奠定了基础。     

天祝白牦牛金属硫蛋白基因的克隆及表达

运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝白牦牛MT-2基因全长为410bp(GenBank登录号:KF888633),ORF长185bp,编码61个氨基酸.该基因无跨膜结构,为非分泌型蛋白.构建系统进化树结果显示,天祝白牦牛MT-2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性,与黄牛和羊的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,双标准曲线法特异性强、灵敏度高、稳定性好,对天祝白牦牛MT-2的定量检测具有重要意义.