水牛α-清蛋白基因3’端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3’端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性。序列分析结果表明：水牛α-乳清蛋白基因3’端序列与牦牛该基因在641bp的序列中存在34bp的差异,同源性为94．69％。     

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。     

盐芥ThNHX1基因的3’RACE

以盐芥为材料，依据拟南芥AtNHX1基因的序列信息设计引物，扩增出盐芥中ThNHX1基因的部分序列，然后使用快速扩增cDNA3’末端（3’RACE）方法，从盐芥中克隆到ThNHX13’cDNA序列。该序列全长680bp，编码104个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AtNHX1基因的相应序列同源性分别为91％和91．5％，而盐芥ThNHX1基因3’端非翻译区序列与拟南芥相应序列的同源性为68．5％，明显低于编码区。     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、Splign、MEGA v6.0、BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5’端非编码区（5’-UTR）、592 bp的3’端非编码区（3’-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0～3...     

合浦珠母贝C型凝集素2的序列特征和表达分析

构建了合浦珠母贝(Pinctada fucata)的cDNA文库,并通过EST序列筛选和重新测序获得了一个新的C型凝集素基因的cDNA序列,命名为PoLEC2,其长度为1 659 bp,5’端非编码区为39 bp,3’端非编码区为45 bp,开放阅读框为1 575 bp,可编码524个氨基酸;PoLEC2蛋白的分子量约58.0 kD,等电点为5.2;PoLEC2蛋白包含一个信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明,PoLEC2与其他物种C型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5%～33.6%,相似性在45.1%～55.6%。组织表达分析表明,PoLEC2基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达,经溶藻弧菌刺激后8h在肠组织中的表达量显著上调。     

团头鲂主要组织相容性复合体Ⅰ类基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

为了解团头鲂MHCⅠ类基因的结构,采用cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术,首次成功克隆了团头鲂“浦江I号” F₀基础群体及选育F₈世代的MHCⅠ类基因,共获得3条cDNA全长序列。序列全长为2 040～2 079 bp,含有87~102 bp的5′-UTR,1 035～1 044 bp的编码区（包括信号肽,alpha 1、alpha 2和alpha 3三个结构域,跨膜区和胞质区）及911~946 bp的3′-UTR区,分别编码347、344个氨基酸。F₈世代序列的核苷酸/氨基酸的同源性很高,为89.0%/93.0%,而与F₀世代的同源性较低（75.3%~77.0 % 和71.1%~71.4%）,呈现出明显的分子多态性。分析表明,团头鲂具有经典的MHCⅠ类分子的空间结构,与人类HLA-A2的抗原肽结合区的晶体结构相比,二者的差异主要集中在5个(I~V)区上。在Neighbor-joining(NJ)法构建的分子进化树中,团头鲂与草鱼的亲缘关系最近,与鲑鳟鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类及人类的亲缘关系则渐远。RT-PCR组织表达分析表明,团头鲂MHCⅠ类基因在所检测的的8个组织中均表达,在鳃、头肾和血液中有较强的转录本,中等强度表达于肝脏和脾脏,在后肾、肠和肌肉中表达较弱。     

草鱼E3泛素连接酶Nrdp1基因cDNA克隆和表达分析

神经调节素受体降解蛋白1(neuregulin receptor degradation protein-1,Nrdpl)是一种新的E3泛素连接酶,可调节细胞增殖和凋亡等。研究采用RACE方法从草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝脏中克隆了Nrdpl的全长cDNA序列;采用半定量RT-PCR方法分析该基因在草鱼不同组织中表达情况。结果表明:该序列全长cDNA大小为1 865 bp(GenBank登录号:JX864048),其中开放阅读框为954 bp,编码318个氨基酸,预测分子量大小为36.09 ku,pH为7.0时理论等电点为5.83;5’和3’非翻译区的长度分别为291 bp和620 bp,在3’非翻译区发现2个mRNA不稳定信号(ATTTA)和1个多聚腺苷酸加尾信号(ATTAAA)。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,其二级结构主要以α-螺旋为主,不含β-折叠。氨基酸序列保守性分析表明,草鱼Nrdp1与斑马鱼、虹鳟及人的同源性分别为98%、94%和89%;该基因在心脏和脑中的表达量较多,在肌肉和血液中表达很少。     

大白菜PHK4基因cDNA3′端序列的克隆及分析

采用3′RACEcDNA末端扩增技术,克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp,其中编码区序列546bp．编码181个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥爿HK4基因的同源性分别为90％和96％．说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高,而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52％,远低于编码区。     

虹鳟PDCD6基因cDNA全长的克隆与功能预测

程序性死亡因子6（PDCD6）基因编码1个含EF-hand结构域的钙离子结合蛋白。应用逆转录PCR及cDNA末端快速扩增（RACE）技术从虹鳟（Oncorhynchus mykiss）脑组织中克隆了PDCD6基因cDNA的全序列（GenBank No：FJ591154）。序列全长1 179bp,其中5’端非翻译区长48bp,3’端非翻译区长567bp,开放性阅读框长564bp,编码187个氨基酸。电子表达谱分析结果表明该基因在4种脊椎动物的多个部位或组织中均有表达。同源模建蛋白三级结构显示该蛋白具有8个主要的α螺旋结构。虹鳟PDCD6蛋白序列与斑马鱼、非洲爪蟾、人、小鼠和鸡的同源性均高于85%,表明PDCD6基因在进化过程中是高度保守的,在细胞程序性死亡过程中发挥重要作用。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

大鲵热应激同源蛋白70基因cDNA克隆及表达分析

结合同源克隆和RACE技术克隆大鲵热应激同源蛋白70基因(hsc70)cDNA序列全长,通过半定量PCR方法分析其在大鲵肾脏、脑、肺、皮肤、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肌肉和垂体组织的表达特点。结果表明:大鲵hsc70基因cDNA全长为2 284 bp(GenBank登录号为HM998289),其中3′端和5′端非翻译区分别为87 bp(1~87)和253 bp(2 032~2 284),中间序列即编码区长为1 944 bp(88~2 031),编码647个氨基酸(AA);其核苷酸序列与其他物种相似性最高达83.5%,而编码的氨基酸序列则相对保守,与钝口螈的相似性达94%;根据其编码的AA序列构建进化树,结果大鲵hsc70首先与两栖类物种聚为一类,不同来源的hsc70基因与分类地位相似的物种分别聚类;半定量PCR结果表明,hsc70基因在大鲵的10种组织中都以较高的水平表达,但存在组织差异,在肾脏、脑、肺、皮肤、肝脏、胃、脾脏中表达量相对较高,在心脏中表达量次之,在肌肉和垂体中表达较低。     

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa~175aa)和CARP(65aa~102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%~53%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。     

草鱼JAK2基因片段序列的克隆及其组织表达分析

通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法从草鱼肝脏中首次克隆获得草鱼JAK2基因的片段序列。该片段序列长671 bp,编码223个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼JAK2基因片段与其他物种的相似性在70%～91%之间;系统进化树显示,鱼类的JAK2独立聚成一支,草鱼与斑马鱼聚成一支,与鳜鱼和墨绿凹鼻鲀聚成的一支再聚成一支。实时荧光定量PCR分析表明,草鱼JAK2基因在肝脏、肌肉、脑、心脏、脾脏和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在肝脏组织中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),其次是肌肉、脑、脾脏和肠系膜脂肪组织,在心脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P<0.05)。本研究为进一步研究草鱼JAK2基因的结构和功能奠定了基础。研究亮点:JAK2基因在鱼类上的研究报道甚少。本研究首次克隆了草鱼JAK2基因片段序列;且发现JAK2基因在肝脏组织中表达量最高,心脏组织中表达量最低,为草鱼JAK2基因的结构及其信号转导等生理功能的深入研究奠定了基础。     

西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因的克隆与表达模式分析

摘要[目的]克隆西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum La3xm．）乙二醛酶Ⅱ基因并了解该基因表达模式。[方法]应用RACE技术和实时荧光定量PCR技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的乙二醛酶Ⅱ基因的cDNA序列,并对该基因在不同胁迫时间、不同组织的表达差异进行了比较。[结果]克隆的乙二醛酶Ⅱ基因cDNA为890bp,其中开放读码框为765bp,编码254个氨基酸,5’非翻译区为49bp,3’非翻译区为72bp,GenBank中登录号为HM241910。序列比对分析结果表明,该基因编码的乙二醛酶Ⅱ与乙二醛酶Ⅱ三型匹配最佳,并具备乙二醛酶Ⅱ的GloB、ComEC和Lactamase,B等结构域。实时荧光定量PCR分析显示,乙二醛酶II基因在正常生长的西伯利亚蓼地下茎、茎与叶中都有表达,其中茎的表达量最高。同时,乙二醛酶Ⅱ基因受3％NaHCO,胁迫诱导,其在不同部位的表达模式有差异。[结论]克隆了西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因并初步阐明了其表达模式。     

草鱼CRP基因全长cDNA的克隆及其表达分析

利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520 bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889 bp,含有1个672 bp的开放阅读框,两侧分别有74 bp和143 bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame, ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,结果表明,CRP基因在7种组织中均有表达,表达水平差异不明显.在人工感染24 h后,各组织中CRP的mRNA水平平均升高5倍左右,与哺乳动物和一些鱼类在炎症反应中血清CRP水平升高一致,而人工感染48 h后,除心脏和肌肉组织中有显著降低外,其他组织没有明显变化,仍维持较高水平.     

版纳微型猪近交系TNF-α基因克隆、序列分析及分子系统进化研究

分别提取版纳微型猪近交系18种组织的RNA,反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增肿瘤坏死因子(TNF-α)基因编码区全长序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与其他15个物种构建系统进化树。同时采用半定量RT-PCR方法分析TNF-α基因在版纳微型猪近交系18种组织中的表达情况。结果显示,版纳微型猪近交系TNF-α基因编码区全长699 bp(GenBank登录号:JF831365),编码232个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与猫等12个物种具有80%以上的相似性,分子系统进化表明与牛、山羊、绵羊及海豚的关系较近。多组织半定量RT-PCR研究表明,TNF-αmRNA在版纳微型猪近交系的多个组织中均有表达,其中在中脑、卵巢、脾、肺、神经及胃中表达量较高。     

建鲤极长链脂酰辅酶A脱氢酶基因cDNA克隆及相关定量表达分析

[目的]克隆建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)极长链脂酰辅酶A脱氢酶(VLCAD)基因cDNA序列,并分析其表达情况,为揭示鲤鱼脂肪酸代谢机理提供理论依据.[方法]以建鲤为研究对象,利用RT-PCR、RACE克隆VLCAD基因的cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对VLCAD基因在不同组织、脂肪源及饥饿胁迫等条件下的表达情况进行分析.[结果]扩增获得的建鲤VLCAD基因cDNA序列全长2527 bp,包括296 bp的5’非翻译区、1974bp开放阅读框(OFR)及257bp的3'非翻译区,共编码659个氨基酸;建鲤VLCAD氨基酸序列包含FAD结合位点、底物结合位点、催化位点,具有ACADs家族的特征性结构;与鲤科类斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,达94％.建鲤VLCAD基因在性腺、肌肉、肝脏、前肠、肾脏、心脏和脑中均有表达,且以心脏的表达量最高,前肠的表达量最少.鱼油和亚麻油对建鲤VLCAD基因在肝脏和肌肉中的表达无显著影响(P＞0.05),但饥饿状态下肌肉中的VLCAD基因表达量显著高于正常状态(P＜0.05).[结论]建鲤VLCAD基因在富含线粒体且脂肪酸代谢旺盛的组织器官中高效表达,对脂肪酸β氧化起调控作用,尤其在饥饿状态下对脂肪酸氧化调控作用明显增强,能促进脂肪酸分解为机体供能.     

凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

[目的]分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化.[结果]LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)cDNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸.LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近.LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低.经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化.[结论]WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定.LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用.     

甘肃马鹿肌细胞生成素（MyoG）基因启动子区序列克隆与分析

MyoC基因在肌肉发生过程中具有中心调节作用。根据GeneBank中已发表的猪、人、小鼠和牛的MyoG基因5’侧翼和部分第1外显子序列设计PCR引物,采用Touch—DownPCR技术扩增了甘肃马鹿MyoG基因的启动子区序列,构建了重组克隆载体pMD18-T—MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,甘肃马鹿MyoG基因启动子区序列长685bp,其与猪、人和小鼠的同源序列相似性分别为88．1％、84．9％和82．6％,且不同物种间保守性较强。本研究为进一步探讨甘肃马鹿MyoG基因的表达与调控机制奠定了基础。