蒙古冰草肌动蛋白基因片段的克隆与组织表达分析

本研究利用同源序列法分离蒙古冰草Actin基因同源片段,并分析蒙古冰草Actin基因在根、茎、叶中的表达特征。根据禾本科植物小麦Actin基因的保守序列设计1对引物A1,经RT-PCR扩增,从蒙古冰草cDNA中克隆到1个长度为541 bp的Actin基因片段,使用DNAman和DNAUSER等分子生物学软件进行序列分析,结果表明,该序列编码179个氨基酸,并推测该片段具有Actin超基因家族的保守结构域,含有1个ATP结合位点,抑制蛋白结合位点和胶溶蛋白结合位点;该基因片段的氨基酸序列与小麦Actin基因的同源性为99%,与玉米同源性为96%,与水稻同源性为93%。组织器官特异性表达分析结果表明,该基因在根、茎、叶中的表达量恒定。将该基因片段命名为MwACT1,并在GengBank中登记注册,登录号为FJ490410。     

蒙古冰草肌动蛋白基因(MwACT2)克隆与表达分析

本研究应用RT-PCR和RACE技术,从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)中分离到1个肌动蛋白基因,命名为MwACT2。序列分析表明:MwACT2基因全长1506bp,含有1个1131bp的开放型阅读框,MwACT2蛋白长度为376个氨基酸残基,分子量为41.606KDa,理论等电点为5.29,含有actin保守位点,属于actin家族成员。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中乌拉尔图(Triticum_urartu)肌动蛋白(登录号:EMS62134.1)氨基酸具有99%的一致性,属于非跨膜蛋白。利用半定量RT-PCR技术分析MwACT2基因的表达,结果表明该基因表达稳定,经高盐、干旱、低温处理后的表达强度无显著差异。     

蒙古冰草脱水素基因生物信息学识别及表达分析

为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)干旱胁迫响应的脱水素基因,本研究在转录组测序数据的基础上,利用生物信息学方法对蒙古冰草脱水素基因进行理化性质、亚细胞定位、保守基序、系统发育进化分析,对不同干旱处理的脱水素基因进行差异表达分析。结果表明：共筛选到6个具有脱水素蛋白保守结构域的蒙古冰草脱水素基因,蛋白大小在81～275个氨基酸残基之间;分子量在0.83～2.75 kD之间;理论等电点在5.14～10.00之间;6个脱水素基因预测均位于细胞核;AmDHNs基因编码的蛋白均包括motif1和motif2;系统进化树发现DN14936＿c0＿g6,DN18948＿c1＿g4与已知具有抗旱功能的基因具有较高同源性。qRT-PCR分析与对照(CK)相比5个基因在干旱处理下显著差异表达,1个基因的表达量差异不显著,综合转录组测序数据和qRT-PCR分析表明6个基因的表达量随干旱处理时间延长总体呈上升趋势。本研究可为蒙古冰草抗旱相关脱水素基因的生物学功能验证提供理论基础。     

蒙古冰草ERF转录因子生物信息学及其表达分析

ERF(Ethylene responsive factor)家族是植物中一种重要的转录因子,参与植物生长发育和逆境胁迫响应。为筛选蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)抗旱相关的ERF转录因子,本研究利用生物信息学方法对其理化性质、亚细胞定位、保守基序、进化关系及其二、三级结构进行分析,同时对不同干旱处理下的ERF基因进行表达分析。结果显示：筛选得到18个具有ERF结构特征的蒙古冰草ERF转录因子,蛋白大小在70～404aa之间,分子质量在7447.54～43654.9之间,理论等电点(PI)在4.53～11.10之间,其中有2个疏水性蛋白,其余均为亲水性蛋白,大部分定位于细胞核。ERF转录因子的二、三级结构以无规则卷曲为主,推测motif1,motif2,motif3为保守基序。进化关系比对发现AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1,AmERF4-2与已知具有抗旱功能的蛋白具有较高同源性,且在干旱处理的蒙古冰草中显著差异表达。     

蒙古冰草新品系的选育

以内蒙沙芦草为原始群体,采用单株-混合选择法,经过10多年选育获得一个性状表现一致、生产性能良好的新品系.新品系株丛较高大、整齐,一般株高为97～116cm,最高可达122cm,比原始群体平均增高19cm;分蘖力强,生活第二年平均单株丛分蘖数为142个,最多可达160个,比原始群体平均增多40个;牧草及种子产量分别比原始群体提高28.2%和37.7%,而且叶量大,种熟期一致.该品系适宜在我国北方年降水量200～400mm的干旱、半干旱地区种植,可用于放牧地的建植、改良及退化沙化草地植被恢复.     

蒙古冰草分子核型分析

利用荧光原位杂交技术,在蒙古冰草染色体组上进行5S rDNA、45S rDNA以及重复序列pAs1 DNA序列的定位,通过荧光原位杂交信号的强弱、数量、位置进行蒙古冰草染色体的配对及核型分析.结果 表明:蒙古冰草染色体组总长度为91.788μm,平均绝对长度为13.113μm,最长染色体与最短染色体的长度比值为1.44...     

蒙古冰草遗传多样性的等位酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测了内蒙古中东部地区蒙古冰草6个天然居群和2个栽培品种的遗传多样性和居群结构，12个酶位点的多态位点百分率为67.71%，基因多样性指数（He)为0.285，显示出了较高的遗传多样性，从遗传多样性的分布格局来看，8个居群的遗传分化系数Gsr=0.129，表明在总的遗传变异中，只有12.9%的变异存在于居群间，而87.1%的变异存在于居群内，同时，6个天然居群的总基因多样度（HT=0.439)和基因分化系数（GST=0.032)也大于2个栽培品种的相应值（HT=0.423,GST=0.010)。UPGMA聚类分析的结果表明，蒙古冰草居群间的遗传分化与生态环境因子间有着密切的相关性。     

撂荒地蒙古冰草旱作技术研究

在引种试验的基础上，进行了大面积蒙古冰草的旱作种植试验，通过最佳种植时间、方法及配套机具的组合，总结出一套适宜于内蒙古撂荒地种植旱作蒙古冰草的关键技术。该技术简便易行，具有成本低、效益高的特点。     

蒙古冰草新品系的选育

以内蒙沙芦草为原始群体,采用单株-混合选择法,经过10多年选育获得一个性状表现一致、生产性能良好的新品系。新品系株丛较高大、整齐,一般株高为97~116cm,最高可达122cm,比原始群体平均增高19cm;分蘖力强,生活第二年平均单株丛分蘖数为142个,最多可达160个,比原始群体平均增多40个;牧草及种子产量分别比原始群体提高28.2%和37.7%,而且叶量大,种熟期一致。该品系适宜在我国北方年降水量200~400mm的干旱、半干旱地区种植,可用于放牧地的建植、改良及退化沙化草地植被恢复。     

蒙古冰草Afa家族串联重复序列克隆及染色体定位

Afa家族串联重复序列因只出现在小麦及小麦族近缘属物种而得名,本研究从蒙古冰草中克隆得到一个Afa家族序列,长度为233 bp,命名为pAmAfa1,该序列在GENBANK中进行同源序列比对,结果表明该序列与大多数小麦族其他物种的Afa家族串联重复序列存在较高的相似性;系统进化分析表明,蒙古冰草pAmAfa1序列与大赖草pLrAfa3,pLrAfa5序列聚在一起,表明蒙古冰草P染色体组与大赖草的N、X染色体亲源关系较近。为了明确Afa家族串联重复序列在蒙古冰草染色体上的位置,双色荧光原位杂交技术被采用,以pAmAfa1为探针检测到杂交信号出现在染色体的末端或近端部的区域,每条染色体上都有杂交信号,表明Afa家族串联重复序列普遍存在于P染色体组中。     

紫花苜蓿BAN基因的克隆及其生物信息学分析

BANYULS(BAN)基因编码的花青素还原酶是缩合单宁合成有关的一个关键酶.利用同源克隆的原理,采用RACE的方法,从紫花苜蓿中克隆得到了BAN基因(MsBAN),并对其进行了初步的分析.该基因cDNA全长1313bp,包括开放阅读框1017bp,编码339个氨基酸,在N端存在一个NADP结合位点“VIGGTGFVASLLIKQLLEKGY”.实时荧光定量PCR结果表明,该基因在紫花苜蓿荚果中表达量最高,花中最弱.在NaCl和PEG诱导下,MsBAN基因表达量明显高于对照.在外源激素ABA和GA3处理下,该基因被诱导表达.表明单宁可能在紫花苜蓿的抗逆性调控中也起到一定的作用.     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

家蚕表皮基因BmGCP2的克隆及表达谱分析

从家蚕(Bombyxmori)表皮中克隆了一个高丰度表达的基因,根据其编码的氨基酸序列特征,发现是一个富含甘氨酸的表皮蛋白,将该基因命名为BmGCP2(GenBank登录号:EU980611)。进一步对BmGCP2基因进行了组织表达谱和发育时期表达谱分析,发现该基因在家蚕表皮中特异高表达,并且这种高表达一直从家蚕的胚胎发育后期持续到蛾期,表明BmGCP2基因编码的表皮蛋白是家蚕外骨骼的重要组成成分之一。     

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则，参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物，PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收：PCR产物，并将其克隆至pGEM—T Easy载体中，经酶切、PCR鉴定和序列分析，获得重组中间质粒pGEM／HGPRT。重组中间质粒pGEM／HGPRT经Nco I和Sal I双酶切，回收目的片段HGPRT，以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV／HGPRT，转化大肠杆菌DH5a，42℃诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析，表达产物HGPRT的分子量约为23kD，与理论推算值相符，表达率占总菌体蛋白的19％，经间接ELISA检测，表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳(N)蛋白基因的克隆与表达

以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物，通过RT－PCR技术，扩增其核衣壳（N）蛋白基因的cDNA；将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点；将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株，在浓度为1.0mM IPTG和37℃条件下诱导，PHN基因融合蛋白获得了表达；经SDS－PAGE，Western-blot试验，确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的47kD。试验结果证明，在大肠杆菌中表达的TGEV N基因的融合蛋白产物的确具有天然蛋白的抗原性。     

鸭甲型肝炎病毒1型3D基因克隆与表达

提取鸭甲型肝炎病毒1型（DHAV-1）RNA作为模板,进行RT-PCR扩增,得到714bp的3D基因,将纯化的3D基因片段与pMD18-T载体进行连接,构建DHAV-13D基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a（＋）表达载体,筛选获得原核表达载体pET-32a-3D。经ITPG诱导,SDS-PAGE分析表明,3D基因得到正确表达,融合蛋白分子量为71.4kDa。Western blotting结果表明纯化的融合蛋白与DHAV-1阳性血清具有反应性。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的克隆及表达分析

植物硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter,NRT)可有效转运NO3-,提升氮素利用效率.为了解析草地早熟禾(Poa pratensis)适应不同浓度及不同形态氮素、干旱胁迫机理,本研究以草地早熟禾为试材,对NRT1/PTR FAMILY 8.3基因进行克隆、生物信息学分析,并分析了不同浓度及不同形态氮...     

家蚕丝素重链C末端序列分析、克隆及表达纯化

蚕丝主要由丝素和丝胶蛋白组成,其中丝素包括丝素重链,丝素轻链和P25蛋白。丝素重链蛋白分子量大,体外表达困难,难以分离纯化,很难对其结构进行研究。本文通过对丝素重链基因的分析,以家蚕5龄3d后部丝腺cDNA为模板,克隆获得了丝素重链C末端碱基序列,并将其构建到pET-50b(+)表达载体上,转入到大肠杆菌中进行表达,通过镍柱亲和层析纯化获得了丝素重链C末端的融合蛋白,为进一步研究蚕丝蛋白的折叠和组装奠定了研究基础。