弗兰克氏菌转化研究初报

完成了弗兰克氏菌菌株C101,Cc01,CcR03,At4,Hr16和CG01的原生质体分离及Cc01原生质体的再生。将菌丝转化技术用于弗兰克氏菌的转化研究,结果发现,pLAFRI上的四环素抗性基因能在Cc01中表达。此外,Cc01具有卡那霉素抗性。     

农杆菌介导紫花苜蓿子叶遗传转化的影响因素研究

以5-7d的紫花苜蓿无菌苗为材料进行卡那霉素抗性筛选,用RG-2质粒（合VP7基因和卡那霉素抗性基因）和农杆菌（EHA101、EHA105）构建重组质粒,对无菌苗和重组质粒进行共培养,研究菌株类型、菌液浓度对转化效率的影响。结果表明,菌株EHA105对紫花苜蓿的转化率达4％,重悬菌液的0D60。以0．3～0．5为宜,农杆菌侵染时间以10～12min较好;PCR检测结果表明,37株卡那霉素抗性植株中30株为阳性,说明VP7外源基因已整合到受体植物基因组中。     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立

[目的]建立极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体,并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3~4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代,G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统,为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。     

淋病奈瑟菌耐药性调查及耐药基因的定位与转移研究

采用纸片琼脂扩散法检测扬州地区淋病奈瑟菌临床分离株对常用抗生素的耐药性,并研究耐药基因的定位和转移机制。对耐药菌株YZ1008分别提取染色体DNA和质粒DNA,用PCR技术检测氨苄青霉素抗性基因的定位,含抗性基因的质粒DNA转化大肠埃希菌敏感株,观察大肠埃希菌耐药性的变化。结果表明:淋病奈瑟菌扬州分离株对受试的11种抗生素具有严重的耐药性,氨苄青霉素耐药基因在染色体DNA和质粒DNA上都存在,质粒耐药基因的转移可使大肠埃希菌DH5α获得氨苄青霉素抗性。这为淋病奈瑟菌耐药性防控研究积累有益数据。     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

水稻基因枪转化过程中选择标记基因的研究

标记基因的利用是筛选和鉴定基因转化的细胞、组织和转基因植株的有效方法。针对目前植物遗传转化中常用的4种抗性标记基因：卡那霉素抗性基因（nptⅡ）、潮霉素抗性基因（hpt）、草丁膦（Glufosinate）抗性基因（bar）和草甘膦（Glyfosinate）抗性基因（epsps）对水稻遗传转化过程所起的选择作用的差异作了较系统的比较，得到适合水稻遗传转化的合适选择标记基因。     

转座子Tn5诱导菊欧氏杆菌产细菌素菌株突变的研究

通过接合的方法将转座手Tn5从供体菌(Escherichia coli s17/pZJ25t:∶Tn5)转移到菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)产细菌素菌株EchB3上。平板LB上的接合频率约为0.8×10~(-8)/每个受体细胞,而滤膜上的接合频率为0.3×10~(-7)/每个受体细胞。2200个接合子只带有转座子Tn5的卡那霉素(km)抗性标记,而没有载体上的氮霉素(Cm)抗性标记,也没有检测到载体质粒。试验证明供体菌中的载体质粒(pZJ25)不能在EchB3中复制表达。因此供体菌株是对菊欧氏杆菌基因分析的良好工具。从2200个接合子中提取全DNA和质粒DNA转化到去质粒的菊欧氏杆菌菌株EchB3rcl,能得到恢复产细菌素的转化子,从而进一步肯定了菊欧氏杆菌EchB3中的质粒在产细菌素中的作用。     

以吡啶硫胺素抗性基因为选择标记的红曲菌原生质体转化研究

[目的]以吡啶硫胺素抗性基因(Pyrithiamine Resistance Gene,ptrA)为选择标记基因,对红曲菌原生质体转化体系进行研究,以期为红曲菌基因功能的研究奠定基础。[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将含有吡啶硫胺素抗性基因(ptrA)的pPTRⅡ质粒转入橙红色红曲菌AS3.4384原生质体中,随机挑选5个转化子,通过PCR方法和Southern杂交对转化结果进行检测,验证pPTRII质粒是否整合到转化子染色体DNA中。[结果]pPTRⅡ质粒转入红曲菌AS3.4384原生质体中的转化率为20～24个/μg,PCR检测结果显示,基因组DNA中有吡啶硫胺素抗性基因的存在,Southern杂交分析发现,ptrA基因随机整合到了转化子的染色体上,该结果表明ptrA基因可用作红曲菌转化的选择标记。[结论]该研究是吡啶硫胺素抗性基因在红曲菌中的首次转化研究,试验结果为红曲菌的基因功能研究奠定了基础。     

根癌农杆菌介导观赏羽衣甘蓝遗传转化体系优化

为建立稳定的羽衣甘蓝遗传转化体系,以羽衣甘蓝自交系'Mark 10','W02-7'和'Curly 6'为试材,通过单因子试验,比较羽衣甘蓝子叶、子叶柄、子叶片、下胚轴4种外植体的再生能力,筛选培养基中的适宜激素浓度,优化了羽衣甘蓝不同外植体的再生体系。将播种后6d的子叶于最适再生培养基上进行黑暗预培养,以根瘤农杆菌为介导侵染子叶后,于黑暗条件下进行农杆菌与植物材料的共培养。随后转入含有头孢霉素的抑菌培养基中进行抑菌培养,再将子叶移入含有卡那霉素浓度的筛选培养基中进行抗性芽选择,并提取植物基因组DNA进行目的基因的PCR验证,从而建立高效的羽衣甘蓝遗传转化体系。结果表明:最佳的外植体是羽衣甘蓝的子叶,在培养基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1上,不定芽分化率可达100%;子叶经2～3d预培养,将OD600值为0.3～0.5的携带DFR基因表达载体的农杆菌菌液离心,以50mL MS重悬液重悬,侵染外植体5min,共培养2d;采用头孢霉素300mg·L-1,抑菌培养3d后,采用10mg·L-1卡那霉素进行抗性芽选择。在播种后30～40d共获得了24个抗性芽,以抗性芽的基因组DNA为模板进行PCR扩增,9株呈DFR阳性,显示外源基因已经成功整合到羽衣甘蓝基因组中,平均转化率为37.5%。本研究结果可以为羽衣甘蓝重要性状基因的遗传转化提供依据。     

农杆菌介导的绿木霉ZBS6的T-DNA转化研究

应用农杆菌介导的T - DNA转化技术,成功转化了生防绿木霉(Trichoderma viride)ZBS6,共获得368个转化子,转化效率为每106个分生孢子产生92个转化子.PCR和Southern blot分子鉴定以及遗传稳定性测定结果表明:转化子T - DNA插入率为90％,均能够稳定遗传,且T-DNA单拷贝插...     

农杆菌介导尖孢镰刀菌西瓜专化型转化体系的建立及突变体筛选

以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。     

根癌农杆菌介导火龙果溃疡病菌遗传转化体系的构建及转化子筛选

为了探究火龙果溃疡病病原菌的致病机理,笔者利用农杆菌介导的遗传转化技术,分析了根癌农杆菌浓度、分生孢子萌发时间以及共培养温度等3个主要因素对遗传转化效率的影响,建立火龙果溃疡病菌的遗传转化技术体系,并对转化子进行筛选。结果表明,当农杆菌浓度OD₆₀₀=0.5、分生孢子萌发时间24 h、共培养温度25 ℃时遗传转化效率最高（833个转化子/106分生孢子）;随机挑选200个转化子进行筛选,获得3株菌落形态与野生型菌株差异较大的转化子,4株产孢量减少的转化子,5株产孢量增加的转化子,6株致病力下降的转化子。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。     

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及其在烟草中的表达

利用PCR克隆了大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因(betB),构建了含betB基因的重组植物表达质粒载体pLM47,并用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草叶片进行遗传转化。结果表明,在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获得基因转化烟草植株3株;经报告基因GVS的组织化学检测和Western blot检测,证明betB基因在烟草转化植株中得到了表达。     

用荧光蛋白基因分子标记生防青霉Penicillium striatisporum Pst10

采用根癌农杆菌AGL-1介导的方法,对生防青霉Penicillium striatisporum Pst10进行绿/黄色荧光蛋白-遗传霉素抗性双标记,研究标记前后菌株的生长差异以及拮抗性能的变化.以Pst10的新鲜菌丝体为受体,获得12个青霉Pst10的绿色荧光蛋白-遗传霉素抗性(GFP-Gen)双标记菌株,转化率0.24%;获得14个青霉Pst10的黄色荧光蛋白-遗传霉素(YFP-Gen)抗性双标记菌株,转化率0.28%.在所获得的转化子中,部分双标记转化子的生长速度和拮抗性能有不同程度的改变,分别筛选获得1株和3株生长速度和拮抗性能与野生型没有明显差异的GFP-Gen和YFP-Gen双标记转化子.     

Development of Highly Efficient Transformation System of Yeast-Like Conidia of Tremella fuciformis

Tremellafuciformis is one of higher basidiomycetes. Its basidiospore can reproduce yeast-like conidia, which is also called the blastospore by budding. The yeast-like conidia of T. fuciformis is monokaryotic and easy to culture by submerged fermentation similar to yeast. Thus, it is a good recipient cell for exogenous gene expression. In this study, the expression plasmid pAN7-1 （containing promoter gpd-An derived from Aspergillus nidulans and selectable marker gene hph conferring resistance to hygromycin B） and plasmid pLg-hph （containing promoter gpd-Le derived from Lentinula edodes and selectable marker gene hph） were transformed into the yeast-like conidia of T. fuciformis by PEG-mediated protoplast transformation, respectively. The primary putative transformants were selected by the sandwich screening method with the selective medium containing 50 μg mL^-1 hygromycin. The putative transformants were obtained from the primary putative transformants transferred on PDSA plates containing 100 μg mL^-1 hygromycin for second round selection. Experimental results showed that the optimal concentration of PEG 4000 for mediating protoplast transformation was 25%. PCR and Southern blotting confirmed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of the yeast-like conidia of T. fuciformis with plasmid pLg-hph transformation. Its transformation efficiency was 110 transformants per μg DNA, and the hph gene was integrated into the genome of some yeast-like conidia with plasmid pAN7-1 transformation. However, its transformation efficiency was only 9 transformants per μg DNA. The presence of hph gene in the genome of transformants after 5 generations of sub- culturing on PDSB medium was confirmed by PCR, suggesting that the foreign gene hph was stable during subculture.     

链格孢菌苹果致病型的ATMT转化体系的建立

【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含10⁵孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,10⁷个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。     

渝东北中山区典型土壤的系统分类

以渝东北中山区(海拔>800 m)为研究区域,选取该区域8个典型土壤样点,通过剖面挖掘、野外观测和分层样品分析等方法,明确供试剖面的形态特征和理化性质,检索出上述典型土壤的诊断层与诊断特性,探讨其在中国土壤系统分类(CST)中的归属,并与发生分类进行参比。结果表明,在8个供试土壤剖面中,除旱地外,林地及牧草地土壤具有淡薄表层,在坡度较小和土壤侵蚀较弱的情况下土壤大都可以形成黏化层,碳酸盐岩风化物发育的土壤均符合碳酸盐岩岩性特征,海拔800 m以上土壤符合常湿润土壤水分状况。8个供试土壤剖面分别被划归3个土纲(淋溶土、雏形土、新成土),3个亚纲(常湿淋溶土、常湿雏形土、正常新成土),3个土类(钙质常湿淋溶土、钙质常湿雏形土、湿润正常新成土),5个亚类(腐殖钙质常湿淋溶土、普通钙质常湿淋溶土、腐殖钙质常湿雏形土、普通钙质常湿雏形土、石质湿润正常新成土),其中,被划归为淋溶土土纲的剖面数量最多(共4个剖面),说明该区域土壤淋溶作用明显。黄棕壤、棕壤、黄色石灰土和黑色石灰土亚类均参比到了CST的钙质常湿淋溶土土类,黄棕壤性土和山地灌丛草甸土亚类均参比到了CST的钙质常湿雏形土土类,棕壤性土亚类参比到了CST的湿润正常新成土土类。按照土族和土系的划分标准,8个供试土壤剖面建立了8个土族,划分出8个土系。