嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.     

2株猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析

参考GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计2对引物,通过PCR技术扩增出2株PCV2流行株的全基因,并进行了序列测定分析.结果表明,2个分离株基因组全长分别为1 767 bp和1 768 bp,2个分离株之间的核苷酸相似性为97.3%,与GenBank上已发表的PCV2分离株之间的相似性为93.8%～99.3%.2个分离株的ORF2核苷酸序列相似性分别为91.3%～99.6%和90.6%～98.0%,存在一定的变异.     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF3 T淋巴细胞抗原表位的克隆与原核表达

根据Stevenson筛选出来的3个具有活性的T淋巴细胞抗原表位(T lymphocyte epitope,TCE)合成tce基因(180 bp),成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD-TCE.将tce酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒,命名为pET-TCE.用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示合成基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为25 000,Western-blot分析结果表明,获得的融合蛋白可与猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型的血清学检测

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(His-CAP2)为抗原,通过方阵ELISA滴定,确定了His-CAP2的最适包被浓度为6.4μg·mL-1,待检血清稀释度为1:40,建立PCV2的血清流行病学的间接ELISA监测方法.通过对已知PCV2血清及其他病毒血清的试验,表明该ELISA方法具有良好的特异性.利用该方法对来自苏中地区不同猪场的175份血清样本进行检测,PCV2抗体阳性检出率为70.29%,与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况相符合,证实了此方法临床应用的可行性.     

猪圆环病毒2型HBZX株的全基因组克隆及序列分析

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序列测定与分析.结果显示,PCV2 HBZX株的基因组全长为1 767nt:同源性比较发现,HBZX株与其他PCV2株的核苷酸同源性为95.0%～98.9%;遗传进化树分析表明,根据PCV2全基因组序列和ORF2编码蛋白的氨基酸序列所绘制的遗传进化树相似度较高;PCV2可分为两个亚型,以中国株为代表的亚洲株和以加拿大株为代表的美洲株分布在亚型1中,以法国株为代表的欧洲株分布在亚型2中.说明PCV2各分离株之间存在较为明显的地理位置上的相关性.     

7株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆及序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型的ORF2序列,设计l对引物,运用PCR方法,对中国动物卫生与流行病学中心监测室从福建、湖南和辽宁3省分离的7个毒株进行ORF2基因扩增.将其克隆到pGEM-T easy载体,筛选阳性重组质粒进行测序.应用DNAstar软件将测序结果与国内外参考毒株进行比对,并对Cap蛋白的细胞表位、糖基化位点等进行分析.结果表明,HUN、HUN-2和LN-19分离株ORF2基因大小为702 bp,编码233个氨基酸;FJ-3、FJ-4、HUN-11和LN-3的ORF2基因大小为705 bp,编码234个氨基酸.Cap蛋白5个表位区A(47～63)、B(65～87)、C(113～139)、D(165～200)和E(C端最后4个氨基酸)均发生一定变异.同源性分析表明,24株序列同源性为90.5%～99.9%,FJ-3与美国株同源性最低(90.5%),HUN和AF055393、DQl80392同源性最高(99.9%);FJ-3和FJ-4为94.5%,HUN-11和HUN-2为94.3%,HUN和HUN-2为99.3%,HUN和HUN-11为95%,LN-3和LN-19为94.7%,表明各地区ORF2基因比较稳定,但也存在一定差异.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2.将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白.通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础.     

病料中猪圆环病毒(PCV)的分型检测及PCV2型不同毒株的培养

对湖南各地区送检猪病料进行了猪圆环病毒(PCV)的PCR检测,并对PCV阳性病料的DNA进行了猪圆环病毒1(PCV1)与PCV2的PCR分型检测。结果表明：送检的192份样品中,有117份为PCV阳性;117份PCV阳性样品全部含有PCV2的DNA,其中2份既有PCV2也有PCV1的DNA;对病料中的PCV2进行克隆, 获得的序列均为PCV2–1基因组,对其中2株毒株的序列进行感染性克隆病毒的构建,拯救的病毒命名为PCV2(2–1)和PCV2 (4–1);对PCV2(2–1)和PCV2 (4–1)进行培养,结果2株病毒均可以在换液维持的细胞中有效的复制。     

猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性分析

【目的】在昆虫细胞表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap),并对表达的重组蛋白~*Cap进行免疫原性分析。【方法】将含有PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-ORF2转染昆虫细胞进行蛋白表达试验,再用纯化的~*Cap和质粒pcDNA3.1-ORF2分别免疫小鼠,比较二者的免疫效果。【结果】由PCV2-ORF2基因编码的Cap结构蛋白在昆虫细胞中正确表达,相对分子质量约为32 000。~*Cap能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。~*Cap免疫组在细胞免疫水平及体液免疫水平的免疫效果均优于pcDNA3.1-ORF2免疫组。【结论】重组蛋白~*Cap可替代全病毒,具有PCV2疫苗潜在的应用价值。研究结果为后续的PCV2病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定试验基础。     

表达PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒对小鼠的保护力试验

PCR扩增猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白(Capsid)基因,鉴定后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastBac-Cap,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经转座作用,蓝白菌落筛选得到含cap基因的重组穿梭载体Bacmid-Cap,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒reBacCap,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使reBac-Cap感染的Sf9昆虫细胞出现特异性绿色荧光,表明reBac-Cap在Sf9细胞中成功表达PCV2-Cap蛋白.动物试验表明该重组病毒对小鼠有一定的保护力.     

猪圆环病毒2 型疫苗研究进展

疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)的主要方式,PCV-2疫苗的研究与开发已成为国内外兽医工作者的关注热点.在国际市场上销售的商品化PCV-2疫苗主要包括亚单位疫苗、嵌合病毒疫苗和灭活疫苗,其中PCV-2灭活疫苗已在我国规模化猪场中广泛使用.综述了近年来国内外各类PCV-2疫苗研究进展及存在的问题,以期为猪圆环病毒病的防制与PCV-2新型疫苗的研发提供参考.     

猪圆环病毒Ⅱ型特异抗体检测间接ELISA法的建立

利用巴斯德毕赤酵母表达的猪圆环病毒2型株Cap蛋白为包被抗原,成功地建立了一种检测血清中PCV-2特异抗体的间接ELISA方法.确定了血清样品阴、阳性判定标准.临床检测结果表明,自建ELISA试剂盒具有较高的敏感性和特异性.     

白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2.     

一例猪圆环病毒病的诊断

2007年4月洛阳市某猪场发生一例猪圆环病毒病.根据猪圆环病毒ORF2基因序列设计、合成1对引物,应用PCR技术对病死猪的血液和脾、肺、肾和淋巴结等内脏组织进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的目的片段.结合流行病学调查、临床症状和病理剖检变化,确诊为猪群发生猪圆环病毒Ⅱ型感染.