辣椒细胞质雄性不育系与其保持系基因组DNA的RAPD分析

利用RAPD技术对细胞质雄性不育系21A与其相应保持系21B的基因组DNA进行了比较分析,共使用了380个随机引物,其中有213个引物在两系之间都得到了扩增产物,不育系21A与相应保持系21B基因组DNA用213个引物扩增后有6条主差异带,主要表现为条带数目、条带位置和条带强弱的差异.找到了辣椒细胞质雄性不育系21A基因组DNA特异的RAPD片段CMS Y15500、CMS BE5850和CMS BG1900,并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育中的作用进行了讨论.     

辣椒细胞质雄性不育相关线粒体基因片段的克隆及序列分析

【目的】探究3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料的不育分子机理,寻找与雄性不育相关的基因。【方法】采用高盐-蛋白酶K法提取辣椒细胞质雄性不育系及其保持系的绿色叶片线粒体DNA(mtDNA),根据已报道的辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,利用PCR反应,从3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料线粒体基因组中均扩增出330 bp左右大小的条带。【结果】经克隆测序及序列分析表明,3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料所获片段序列完全一致,大小为330 bp,命名为CMS330,与orf456核酸序列同源性达99%。【结论】3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料具有相似的不育分子机理。     

辣椒细胞质雄性不育恢复基因的AFLP标记

采用AFLP技术对辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的恢复系湘紫基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物PstⅠ-NNN+MseⅠ-NNN组合,有58对引物组合在两系间扩增出5156条带,多态性位点为4个,主要表现为条带数目、条带位置和条带强弱的差异。其中在恢复系材料中仅有3个多态性片断,找到了辣椒细胞质雄性不育恢复系湘紫基因组DNA特异的AFLP片段ACA/CGC300、AGT/GGT375和AGC/CGC380,并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育恢复系中的作用进行了讨论。     

洋葱细胞质雄性不育基因分子标记的开发

根据细香葱orf A501开发的特异引物,以洋葱细胞质雄性不育系为试材进行PCR扩增,对获得的片段进行回收测序,根据测序结果设计引物进行染色体步移,获得部分侧翼序列,开发了鉴定洋葱细胞质基因型的SCAR标记,命名为OC2175。该标记在洋葱不育系中扩增出一条2 175 bp的特异条带和1 053 bp的条带,而保持系中仅扩增出1 053 bp的条带。对17组不同遗传背景的不育系及其相应的保持系进行验证,该SCAR标记的鉴定结果与田间表型判断结果完全吻合。     

辣椒胞质雄性不育基因的分子标记

利用近等基因系原理和RAPD标记技术对辣椒胞质雄性不育基因组DNA及其保持系基因组DNA进行了比较分析,通过200条随机引物的RAPD扩增,获得了与不育基因连锁的RAPD标记BH19-S900。测序结果表明,不育标记BH19-S900序列全长864 bp。根据RAPD标记序列分别设计并合成双引物,将与不育基因连锁的标记BH19-S900转化为更为简单、稳定的SCAR标记SS730。     

V型小麦细胞质雄性不育“三系”及杂交种线粒体DNA的比较研究

以V型小麦细胞质雄性不育系及相应的保持系、恢复系以及其杂种F1为材料,用ISSR、SRAP、RAPD分子标记技术对它们的线粒体DNA进行了比较分析。结果如下:(1)153个SRAP引物组合中139个组合扩增出了多态性,9个组合扩增出不育系特有而保持系、恢复系、F1均缺失的片段,3个组合扩增出不育系特异缺失的片段。(2)92个ISSR引物中45个扩增出了多态性,筛选到了6个不育系特有而保持系、恢复系及杂种F1均缺失的片段。(3)288个RAPD引物中281个扩增出了多态性,4个引物扩增出不育系特有的片段,3个引物扩增出不育系特异缺失的片段。在对线粒体DNA进行分析时,SRAP比ISSR多态性好,比RAPD稳定性好。     

新型甘蓝型油菜CMS选育及分子鉴定

以榨菜细胞质雄性不育系(CMS)为不育胞质来源,甘蓝型油菜自交系为父本,通过连续回交定向选育方法进行榨菜胞质甘蓝型油菜CMS的转育,获得了原始不育系‘93-12A’,并通过父本载体的转换对其进行改良,获得了一份综合性状较优良的不育系‘嘉油58A’;根据已报道的油菜CMS相关基因orf224、orf138和叶用芥菜CMS相关基因orf220设计特异引物,对榨菜胞质甘蓝型油菜CMS及其保持系的基因组DNA进行PCR扩增,结果显示,仅orf220的特异引物能在原始不育系‘93-12A’和改良不育系‘嘉油58A’中扩增出特异条带,扩增产物序列与orf220具有100%的同源性,从而从分子水平验证‘93-12A’和‘嘉油58A’的不育胞质来源于榨菜。     

白菜Ogura细胞质雄性不育基因组的AFLP分析

采用AFLP( Amplified fragment length polymorphism)技术对白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)细胞质雄性不育系Y3611A及其相应的保持系Y3611B基因组DNA进行多态性比较,64对引物中有61对引物组合在两系间扩增出5 185条带,其中有3对引物在不育系Y3611A中扩增到3个特异片段,对特异片段进行克隆、测序,其序列全长分别为187 bp、205 bp和237 bp,将其分别命名为CMS187、CMS205和CMS237.用BLAST进行同源性分析,发现它们分别与大白菜核基因组部分序列、拟南芥衰老相关蛋白mRNA序列及拟南芥线粒体部分序列有较高的同源性.     

甜瓜作图亲本相关序列扩增的多态性分析

以中国甜瓜地方品种自交系4G21(香瓜)和3A832(哈密瓜)为作图亲本,利用SRAP(Se-quence-relatedAmplifiedPolymorphism)分析了甜瓜作图亲本的多态性,结果表明:在184个SRAP引物组合中有176个扩增出多态性条带,不同引物组合扩增的多态性条带的变异幅度在1～15之间,共扩增出614个,平均每个引物组合扩增出3.34个,说明SRAP标记揭示甜瓜作图亲本多态性的效率很高。     

菜薹细胞质雄性不育相关基因orf224的克隆

利用分子标记技术克隆菜薹雄性不育基因,为利用菜薹不育性提供依据.采用间源序列的候选基因法,通过检索NCBI核酸数据库,获得细胞质雄性不育(CMS)相关的基因或开放读码框序列.根据保守区设计1对特异引物.对不育系和保持系的基因组DNA进行PCR扩增.结果表明:特异引物在不育系中扩增出1条675 bp的片段.序列分析表明该片段与Pol型胞质不育orf224基因同源性为100%.CMS特异扩增结果证明试验所用的菜薹其不育类型为胞质Pol型.     

辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析

通过对辣椒细胞质雄性不育(CMS)系及其相应保持系育性相关基因的分析,检寻SNP位点,旨在探索其与辣椒细胞质雄性不育性的关系。以高盐-蛋白酶K法提取线粒体DNA,采用AFLP技术分析了辣椒不育系和保持系的mtDNA的差异,从128对引物扩增产物中发现了不育系和保持系的差异片段,经回收、克隆获得不育系特异片段CanLE长度140 bp,保持系特异片段CanLB长度126 bp。利用Blast对其进行序列比对分析,其中CanLE与细胞色素P450家族蛋白同源,CanLB和赖氨酰-tRNA合成酶同源。进一步分别克隆并获得了不育系和保持系辣椒细胞色素P450全长,序列分析发现,两者存在单核苷酸多态性(SNP),其中5个碱基差异,3个为同义突变,2个氨基酸发生改变。     

不结球白菜Pol胞质雄性不育系和其保持系的RAPD分析及分子标记的筛选

对不结球白菜Pol胞质雄性不育系(CMS)及其保持系基因组 DNA 进行 RAPD 分析,共使用了386条随机引物,其中有346条引物在两系之间都得到了扩增产物,64条引物扩增结果在两系之间表现出了遗传多态性.在其不育系中获得了1条稳定扩增的片段 OPAY1000,序列测定结果表明,OPAY序列全长为 1 053 bp,在GenBank中的登录号为DQ320101.根据序列测定结果设计了1对特异引物,将OPAY1000转化为更稳定的SCAR 标记.     

不结球白菜Pol胞质雄性不育系和其保持系的RAPD分析及分子标记的筛选

对不结球白菜Pol胞质雄性不育系(CMS)及其保持系基因组 DNA 进行 RAPD 分析,共使用了386条随机引物,其中有346条引物在两系之间都得到了扩增产物,64条引物扩增结果在两系之间表现出了遗传多态性.在其不育系中获得了1条稳定扩增的片段 OPAY1000,序列测定结果表明,OPAY序列全长为 1 053 bp,在GenBank中的登录号为DQ320101.根据序列测定结果设计了1对特异引物,将OPAY1000转化为更稳定的SCAR 标记.     

辣椒细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为试材,从苗龄10~15 d的黄化苗中分离纯化线粒体并提取线粒体DNA。线粒体负染后电镜观察发现,分离纯化的线粒体形态完整,呈椭球形,杂质较少。电泳检测提取的线粒体DNA的琼脂糖,结果表明,线粒体DNA纯度较高,无降解现象,浓度为20~50 ng/μl,可用作RAPD分析。经初步筛选,100个RAPD随机引物中有8个引物表现出多态性,经再次重复筛选,获得了辣椒细胞质雄性不育系21A线粒体DNA与雄性不育性相关的RAPD标记CMSAG3430。     

辣椒AFLP技术体系的建立与优化

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为材料,通过对影响辣椒AFLP技术体系的若干关键因素,如提取DNA的方法、酶切与连接、预扩增和选择性扩增以及电泳和染色条件等的研究,建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。采用该体系,对辣椒进行AFLP分析,能够得到清晰稳定的分子标记图谱,为今后利用AFLP技术进行辣椒细胞质雄性不育基因的定位奠定了技术基础。     

棕榈科植物DNA的提取及SRAP引物筛选

采用CTAB法提取棕榈科植物基因组DNA,选用4个棕榈科植物DNA作模板,对100个SRAP引物组合进行筛选,以条带清晰多态性丰富为引物筛选原则,最后共筛选出14个组合作为棕榈科植物SRAP分子标记的核心引物,为后续SRAP分析提供依据。同时还对SRAP-PCR扩增程序进行优化,在不影响扩增效果的前提下,节约了大量实验时间。     

结球甘蓝西园六号种子纯度的SSR和SRAP鉴定

用SSR和SRAP标记技术对结球甘蓝西园六号进行品种纯度鉴定,从94对SSR引物和109对SRAP引物 中分别筛选出4对条带清晰、多态性较高且具有高度区分度的引物.依据8对引物在西园六号及其亲本的聚丙烯酰 胺凝胶电泳检测结果,构建了清晰的品种指纹图谱.通过对特异片段的序列分析,比较了亲本特异片段的碱基差异 并揭示了杂交后代中产生非亲条带的本质,将SSR转化为SCAR标记.SSR和SRAP分子标记构成的DNA 指纹 图谱及SCAR标记,为西园六号品种纯度快速鉴定提供了科学依据.     

两种甘蓝Ogura细胞质雄性不育源的分子鉴别

 【目的】比较两种可实用的甘蓝Ogura细胞质雄性不育源（CMSHY和CMSR3）在细胞质DNA水平上的区别,以快速、准确鉴别两种不育源。【方法】利用开发的叶绿体SSR（cpSSR）和线粒体SSR（mtSSR）引物,结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序技术,获得在两种不育源间的分子差异,并对其中有限制性内切酶的位点转化成CAPS标记。【结果】无法在聚丙烯酰胺凝胶电泳上发现32对cpSSR扩增产物的差异,经测序仅发现ACP9引物上SSR重复数的差异。在21对mtSSR引物中,仅mtSSR2引物可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上区分这两种不育源。经测序发现其余5对mtSSR引物上存在9个多态性差异,其中3个为SSR位点的差异。对其中2个可被限制性内切酶MseⅠ酶切的多态性位点转化成CAPS标记,分别命名为m92-143 MseⅠ、m1-346 MseⅠ。这些标记均可以用于这两种Ogura细胞质雄性不育源的区分。【结论】 利用获得的cpSSR和mtSSR标记,成功区分甘蓝Ogura细胞质雄性不育源CMSHY和CMSR3。CAPS标记可快速、简便、准确地区分两种不育源。     

洋葱细胞质雄性不育系与相应保持系线粒体DNA的RAPD分析

运用RAPD技术对洋葱细胞质雄性不育系A和相应保持系B的线粒体DNA(mtDNA)进行了100个单引物的多态性研究。结果表明69个引物有扩增,表现出多态性的有12个,然后随机选取不育系A和保持系B各9株验证多态性片段在单株中的稳定性,有两种引物A13和E14扩增出的多态性片段表现稳定。     

棕榈科植物DNA的提取及SRAP引物筛选

采用CTAB法提取棕榈科植物基因组DNA,选用4个棕榈科植物DNA作模板,对100个SRAP引物组合进行筛选,以条带清晰多态性丰富为引物筛选原则,最后共筛选出14个组合作为棕榈科植物SRAP分子标记的核心引物,为后续SRAP分析提供依据。同时还对SRAP-PCR扩增程序进行优化,在不影响扩增效果的前提下,节约了大量实验时间。