宏基因组技术构建土壤宏基因组文库研究进展

土壤中大部分的微生物不能被培养,从而限制了对土壤微生物的开发利用,宏基因组技术可以解决这一难题,成为开发微生物资源的一种工具.阐述了宏基因组文库的构建、土壤宏基因组文库的特点及筛选文库获得的一些成果,并分析了构建土壤宏基因组文库存在的问题.     

宏基因组技术在筛选未培养微生物中新型酶的研究进展

介绍了宏基因组文库的构建及酶基因的筛选方法,对瘤胃、土壤及其他环境中微生物宏基因组文库的构建和酶基因的筛选研究进行了综述,同时就宏基因组技术在未培养微生物研究中的应用进行了展望。     

温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

宏基因组学的研究进展

宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养,主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选,可用于发现新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性等方面。笔者对宏基因组学技术的方法和应用作了简要综述。     

稻田土壤细菌宏基因组文库构建

为了从土壤宏基因组文库中筛选获得具有微生物农药活性的化合物及其基因簇,本研究构建了稻田土壤细菌宏基因组文库.采用直接裂解法提取土样DNA并对其纯化,之后RFLP-PCR分析土样DNA中细菌16S rDNA 基因的多样性,最后以提纯的土壤DNA为外源片段,以Fosmid载体构建了土壤宏基因组文库.提取纯化后的DNA片段大于23kb,RFLP-PCR分析土样DNA具有丰富的遗传多样性,构建获得的土样宏基因组文库约含10 000个克隆子,文库容量为3.56×10(8)bp.本研究掌握了构建土壤宏基因组文库的方法,构建的宏基因组文库可为后续的文库筛选以及获得绿色环保的微生物农药奠定了基础.     

环境微生物的宏基因组学研究进展

在当前的实验室条件下自然界中约有99%的微生物不可培养,这使微生物资源的开发利用受到了限制。宏基因组技术通过不培养微生物而直接对环境中总DNA进行克隆筛选来突破这个瓶颈。宏基因组技术现在已经用于各种微生态环境的研究中,大大加深了我们对环境中的微生物多样性以及微生物功能的认识。     

叶围微生物宏基因组文库的构建和分析

宏基因组文库技术是开发利用未培养微生物基因资源的有效途径。采用CTAB-SDS法直接从植物叶面沉积样品中提取基因组DNA,构建了以puc19为载体的基因组文库,共获得8126个阳性克隆,文库DNA总容量约30.1MB,平均插入片段长度为3.8kb。叶围微生物基因组文库的成功构建,对于以后研究植物和叶围微生物的关系有重要意义。     

高糖土壤宏基因组文库β-葡萄糖苷酶基因克隆表达及酶学性质分析

【目的】通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据。【方法】提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质。【结果】成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与Gen Bank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73%;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的K_m值为6.45 m M,V_(max)为50μmol/(mg·min)。在15～50℃热处理1 h后仍保留90%以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活。【结论】宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础。     

土壤微生物的宏基因组学及其研究进展

土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法,是研究土壤微生物生态学的基础,也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。介绍了土壤宏基因文库的构建、筛选及土壤宏基因组研究现状和这一技术的局限性。     

一种基于宏基因组模拟数据的生物标志物筛选方法

鉴于生物圈中微生物资源的巨大开发潜力以及测序技术不断发展,宏基因组学研究的不断深入,微生物群落已经被看作一个整体来进行分析并且已经得到广泛应用。然而由于微生物的多样性以及微生物菌群的复杂性,使得精确确定和定量宏基因组数据中的分类单元成为宏基因组数据分析的难点。已有的宏基因组数据标记分析工具无法解决微生物群落预测结果重现的稳健性、准确性以及处理非冗余标记物方面遇到的问题。笔者提出了一个新的基于宏基因组自助抽样(metagenomic bootstrap)的生物标志物选择方法,它结合了mRMR(minimal redundancy maximal relevance)和自助抽样方法(bootstrapping),可以更加稳健、准确而有效地通过对宏基因组数据的挖掘实现非冗余标记物的筛选。基于模拟数据集,通过其与2种自上而下的方法(Metastats、LEf Se)以及自下而上的方法(Wilcoxon秩和检验)进行对比,表明本方法可以在较高准确率的基础上更加稳健地选择更多的非冗余生物标志物。     

宏基因组学技术在生物冶金中的应用

介绍了生物冶金的发展概况以及制约其推广应用的因素,阐述了宏基因组学技术在生物冶金中的应用,包括在开发新的浸矿微生物资源、揭示浸矿微生物群落种群关系、获取外源功能基因和在浸矿微生物抗性机制研究中的应用,展示了宏基因组学技术推动生物冶金研究发展的巨大潜力。     

基于序列宏基因组学技术的芳香聚酮抗生素的发现

[目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLASTx同源比对分析其所包含的芳香聚酮生物合成基因簇。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱技术确定克隆特异性产物并对发酵产物进行抑菌活性检测。[结果]从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库第493号混合文库中扩增得到了1个KSα片段ZF493,蛋白序列分析显示其与酮基合成酶同源,文库筛选得到了含有其对应芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆cos493。对cos493的测序分析显示其插入片段大小为34 kb,包括酮基合成酶基因(KSα,orf 21)、链长因子基因(KSβ,orf 20)、酰基载体蛋白基因(ACP,orf 19)、环化酶基因(CYC,orf 17和orf 18)、糖基转移酶基因(orf 12)、单加氧酶基因(orf 16)等芳香聚酮合成相关基因。ORF 21与化合物calixanthomycin A聚酮合酶的KSα有67%的相似性,ORF 20与化合物griseorhodin A的KSβ有49%的相似性。通过接合转移使含芳香聚酮合酶基因簇的cos493整合进白色链霉菌宿主基因组中。高效液相色谱分析发酵粗提物发现了2个克隆特异化合物峰,紫外光谱分析显示化合物1在223、296和420 nm处有特征吸收峰,化合物2在214、261和447 nm处有特征吸收峰,特异峰具备芳香聚酮化合物的紫外吸收特征。对发酵粗提物的抑菌活性检测发现,其对金黄色葡萄球菌有抑制作用。[结论]本研究运用基于序列的宏基因组学技术,在链霉菌宿主中表达了来源于土壤微生物的芳香聚酮合酶基因簇并产生了具有抗菌活性的化合物。     

宏基因组技术及其应用研究进展

传统培养方法从环境中只能获得1%左右的微生物,而宏基因组技术作为一种不依赖于培养的新理念和新方法,可以克服上述瓶颈,使从探究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实.宏基因组技术于10年前诞生,至今已取得了令人瞩目的进展.对宏基因组学的概念、方法和应用等方面进行了综述,以期为同类研究提供参考.     

水体宏基因组学研究进展及应用

微生物是水体生态系统中不可或缺的一环,占生物基因资源的绝大多数。目前传统的微生物研究手段只能培养0.1%-1%的环境微生物,无法整体分析水体微生物群落的构成和功能,形成了水体治理研究的瓶颈。近年来,不依赖于培养的微生物研究手段即宏基因组学的出现为解决这一难题提供了新方法。一方面宏基因组学技术可以用于研究水体的生物多样性、微生物系统中的物质代谢历程这些为研究水体污染的治理提供了可能;另一方面,用宏基因组学方法从水体中发现新型微生物来源酶具有极高的应用价值。虽然宏基因组学仍存在一些问题和不足之处,但是近年来也取得了巨大的成就,该文综述了宏基因组学的概念、方法、问题和水体宏基因组学研究进展。     

有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因和微生物多样性研究

采用珠磨法直接从受有机磷污染的土壤和活性泥样品中提取和纯化宏基因组DNA。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物,从宏基因组中扩增有机磷降解酶基因片段。回收扩增产物后,构建了以pEASY-T3为载体的有机磷降解酶基因片段文库。从文库中随机挑选克隆进行DNA序列测定,并分析测序结果,评价有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因的多样性和新颖性。结果显示,88%土壤来源序列与GenBank中同类酶序列相似性在44%~65%之间,97%活性泥来源序列与GenBank中同类酶的相似性在23%~77%之间,且序列多样性极为丰富,显示在有机磷污染土壤和活性泥中含有丰富和新颖的有机磷降解酶基因资源。同时采用PCR-DGGE的方法对有机磷污染土壤和活性泥中微生物多样性进行了初步研究。     

土壤微生物群落结构研究方法综述

综述了土壤微生物传统培养方法和Biolog微平板分析碳素利用法、磷脂脂肪酸法(PLFA分析法)等微生物群落生理代谢研究方法,以及变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限制性长度多态性(T-RFLP)、高通量测序技术及宏基因组等微生物分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用,并对未来的发展趋势进行了展望。     

番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建

利用宏基因组DNA提取试剂盒提取番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组DNA,经PstⅠ和HindⅢ双酶切,回收1-5kb大小的片段,与经过相同酶酶切的PblueScriptⅡKS（＋）质粒载体相连接,转入大肠杆菌DH5a,构建了番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组文库。     

一种新的草甘膦氧化还原酶基因的克隆及活性蛋白表达研究

本研究构建了一个草甘膦污染土壤的宏基因组文库,利用草甘膦抗性筛选方法从该文库中筛选得到一个草甘膦抗性克隆,测序结果表明,其上存在一个草甘膦氧化还原酶(glyphosate oxidoreductase,简称GOX)的编码基因,命名为goxA。该基因长为1 296 bp,编码一个由431 aa组成的蛋白质。goxA碱基序列与已报道的gox相差6个碱基,编码产物GOXA与GOX蛋白质氨基酸序列相差2个氨基酸。为了验证GOXA的功能,对其进行了原核表达与纯化,活性电泳结果表明,GOXA具有明显的草甘膦氧化还原酶活性,goxA的发现为草甘膦抗性植物的研发提供具有潜在应用价值的基因资源。     

瘤胃元基因组BAC文库研究

目前，传统的分离培养技术在瘤胃微生物的研究中仍存在一些无法逾越的障碍。元基因组文库（metagenomiclibraries）及相关技术的发展，为探讨环境中未培养微生物以及复杂的微生物间关系创立了一个新的平台。将该技术应用于瘤胃微生物研究有着广阔的前景。本文综述了元基因组文库技术在瘤胃微生物研究中的应用潜力，同时介绍了初步应用BAC文库研究瘤胃微生物工作的一些进展。