水稻GSK基因家族的鉴定及其对多种激素和逆境应答的表达量分析

通过序列比对分析鉴定出9个GSK同源基因(命名为OsGSK1-9),它们分布在水稻的6条染色体上。聚类分析表明预测的OsGSK蛋白和其他植物中的GSK蛋白可被分为4个亚组。通过实时定量PCR进一步分析了OsGSK基因家族的基因在水稻各种组织和器官以及在多种逆境胁迫和植物激素处理条件下的表达量。结果表明:大多数OsGSK基因在水稻全生育期都有较高的表达量并且受多种激素(如脱落酸、生长素、油菜素内酯)和逆境(如干旱和盐胁迫)胁迫诱导表达,表明OsGSK基因家族在水稻发育和逆境适应过程中可能起重要作用。     

的克隆及表达分析

 逆境对于水稻产量和品质有很大影响，研究在逆境下水稻基因的表达变化对于研究水稻抗逆有着重要意义。该实验运用荧光差异显示(Fluorescence Differential Display, FDD)技术，从低温处理的水稻中克隆到OsRAN1基因并通过半定量PT-PCR分析该基因在低温和高盐逆境下的表达。该基因cDNA序列全长为984bp，含有一个编码221个氨基酸残基的开放阅读框，推测分子量为25.0 KD，此氨基酸序列具有GTPase活性区域，属于小G蛋白Ran亚家族，通过氨基酸相似性比对发现，Ran家族氨基酸序列高度保守，OsRAN1与TaRAN1和AtRAN1相似性分别达到98.19%和92.76%。通过半定量PT-PCR分析，发现在低温胁迫下，OsRAN1在根和叶鞘中表达量均有增加，尤其是高盐胁迫下根中OsRAN1表达量有迅速升高然后降低的变化。推测该基因在水稻逆境应答中起着重要作用。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP1和GhROP8的克隆及表达分析

为探究棉花ROP基因在非生物逆境胁迫及外源激素处理下的表达模式,利用同源克隆的方法获得2个陆地棉(Gossypium hirsutum L.)ROP基因GhROP1和GhROP8,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其组织表达的特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式进行分析。结果表明：1)GhROP1和GhROP8基因的开放阅读框(ORF)分别为591和630 bp,各编码197和210个氨基酸,均含有1个保守的RHO结构域。2)多序列比对显示2个GhROPs蛋白均符合ROP蛋白结构特征且与其他物种ROP蛋白具有高度的相似性,聚类分析表明,GhROP1蛋白属于Ⅰ类ROP蛋白,GhROP8蛋白属于Ⅱ类。3)2个GhROPs基因在不同组织中均有表达且存在组织特异性：GhROP1基因在真叶中表达量最高,在根部和茎部表达量较低;GhROP8基因在根部表达量最高,其他组织中均为低表达量。2个GhROPs基因对于干旱、高盐、低温及高温等非生物逆境胁迫和外源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的处理均有响应：2个GhROPs基因表达均受...     

水稻多逆境响应基因OsGAD3的表达与克隆

逆境胁迫严重影响植物的生长发育,对农业生产造成相当大的影响。为了了解植物逆境反应机理和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix水稻表达芯片分析了籼稻培矮64S在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一个受多种逆境诱导、在各生长发育时期与组织器官均有响应的基因OsGAD3(Oryza sativa L.,Glutamate decarboxylase 3,GenBank登录号为:AY187941.1)。PCR扩增得到了该基因的cDNA,其包含的ORF长1476 bp,编码一个含有492个氨基酸残基的蛋白,分子量约为56 kD,等电点约为5.64。OsGAD3基因编码的蛋白质有多个保守结构域,经序列比对发现,其与水稻谷氨酸脱羧酶3相似性约为99.7%。启动子区域分析,发现多种与逆境反应相关的顺式作用元件,因此推测此基因可能参与水稻的耐逆反应过程。     

水稻类钙调磷酸酶亚基B蛋白质在逆境胁迫下的表达

【目的】了解水稻CBL蛋白质在逆境胁迫下的表达模式进而探讨水稻耐逆的分子机理。【方法】采用基于抗体的蛋白质组学策略,以超级杂交稻父本9311为材料,采用免疫印迹（western blotting,WB）技术调查了CBL家族主要成员在冷、热、旱、淹和盐胁迫等5种逆境中的表达特征。【结果】发现CBL1、CBL5和CBL6在冷胁迫中表达下调,CBL1和CBL2在热胁迫中表达下调,CBL1和CBL5在旱胁迫中表现下调,而CBL6、CBL8和CBL10在旱胁迫中表现上调,CBL1、CBL5、CBL6、CBL8和CBL10在淹涝胁迫中表达上调,而CBL2表现下调。【结论】鉴定了水稻在重要逆境胁迫下发生丰度变化的6个CBL蛋白质。     

水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式

为了探明盐敏感相关基因[OsSsr1（Oryza sativa L.salt-sensitive related gene 1,GenBank登录号为NM₀01065574）]的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro数据库和Real-time PCR对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2 004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质,该蛋白质N端含有一个信号肽;其启动子序列包含TGACG-motif、ABRE、TCA-element和W box等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP融合表达显示,OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro数据库中数据分析表明,OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,胚中的表达量最低。Real-time PCR结果表明,OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA和ABA的诱导上调。这些结果显示,OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

一个水稻抗逆候选基因OsHMGB3的鉴定与评价

OsHMGB3是一个位于水稻抗旱QTL区段内的抗旱相关候选基因,预测编码一个具有HMGB-UBF-HMG-box结构域的蛋白。Real-time PCR分析表明:OsHMGB3基因在多个组织器官中表达,且能够受到PEG、NaCl、低温、高温等逆境及ABA的诱导表达。对超表达OsHMGB3的转基因水稻进行了苗期甘露醇胁迫处理,转基因植株的鲜重和株高均极显著优于野生型植株,超表达OsHMGB3可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力。该基因对逆境的响应及转基因植株对渗透胁迫的抗性均暗示该基因与水稻抗逆性有密切的关系。     

OsBELL4A调控水稻WOX家族基因表达及水稻幼苗生长和耐逆

根系不仅对地上部分起着重要的支撑作用,也是植物吸收水分和养分的主要器官。为了研究BELL家族因子在植物生长发育及逆境胁迫应答中的功能,通过与拟南芥序列对比,鉴定到水稻4个BELL4同源基因,它们的启动子含有ABRE、GARE、ERE、ARE和DRE等应答逆境胁迫和激素信号的元件。在水稻根中进行实时定量PCR分析表明,这4个BELL4同源基因不仅受到干旱、低温以及盐等逆境胁迫诱导,而且还受到植物激素乙烯、赤霉素以及脱落酸的调控,表明这些基因可能应答多种激素及逆境胁迫。进一步分析OsBELL4A干扰材料表型发现,抑制OsBELL4A基因能够促进WOX家族基因的表达水平,并抑制水稻苗期初生根生长,但使冠根数量增多。这些结果表明水稻BELL4同源基因OsBELL4A在水稻根系发育及逆境胁迫应答中可能具有重要的调控功能。     

小麦钙联蛋白基因TaCNX60.0的克隆与表达分析

钙联蛋白(Calnexin)是一类结构和功能非常保守的分子伴侣,在调控生物代谢和Ca2+信号传导等方面发挥重要作用。本研究通过筛选Yr5近等基因系cDNA文库,分离获得1个钙联蛋白基因,将其命名为TaCNX600.。序列分析发现,该cDNA片段包含1个1 921bp的开放阅读框,推测其编码包含535个氨基酸残基的蛋白质。利用半定量RT-PCR分析该基因的表达谱,发现小麦受到植物激素ABA、低温和干旱胁迫处理后,TaCNX600.的表达受到抑制,而条锈菌小种CYR32和白粉菌混合菌系侵染能诱导TaCNX600.表达量增加,说明小麦钙联蛋白基因TaCNX600.可能在植物防卫反应和抵抗逆境胁迫过程中发挥作用。     

巴西橡胶树谷氨酸脱氢酶基因cDNA片段克隆及表达分析

谷氨酸脱氢酶[Glutamate dehydrogenase,(GDH;E.C.1.1.4.2)]在植物处于逆境或胁迫时,发挥着重要的作用,主要功能可能是解除逆境或胁迫条件下高浓度的铵毒害.该研究通过同源克隆从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中获得谷氨酸脱氢酶基因(HbGDH)的部分cDNA片段(GeneBank登录号:DQ672585),基蛋白包含一个谷氨酸脱氢酶保守结构域.BLAST比对表明HbGDH基因与拟南芥(Arabidopis thaliana)、水稻(Oryza sati-va)GDH基因分别有82%、79%的同源率;系统进化树分析发现HbGDH蛋白与拟南芥、水稻GDH蛋白聚为一簇;不同组织的表达分析表明HbGDH基因在胶乳中表达较高,叶片中次之,树皮中最低.     

芹菜韧皮部蛋白质AgPP2-2基因的克隆与表达

以地域来源不同和性状特性差异较大的3种芹菜(六合黄心芹、津南实芹和美国西芹)为试验材料,分别克隆芹菜韧皮部蛋白质基因AgPP2-2。序列分析结果表明,3个芹菜品种的韧皮部蛋白质基因AgPP2-2均含有1个540 bp的开放阅读框及196 bp和167 bp的2个内含子。3种芹菜中的韧皮部蛋白质基因AgPP2-2分别编码179个氨基酸,在核苷酸水平上有4个碱基的不同,编码的氨基酸有3个位点的差异。3个芹菜品种的韧皮部蛋白质AgPP2-2与忽地笑等植物的韧皮部蛋白质相似度较高,具有PP2超家族保守结构域。这些AgPP2-2蛋白质氨基酸组成与理化性质差异较小,都属于疏水性蛋白质,二级结构非常相似,其中卷曲和折叠结构都是主要的组成部分。不同品种芹菜的不同组织表达分析结果显示,3种芹菜中,AgPP2-2基因在茎中的表达量最高,根和叶中其次,花中表达量最低,具有明显的组织特异性。不同逆境处理表达分析结果初步显示,干旱、盐碱、低温、高温胁迫导致芹菜中AgPP2-2基因表达量均有不同程度的下降,高温胁迫大于低温胁迫,干旱胁迫大于盐碱胁迫,这为阐明AgPP2-2基因在芹菜逆境调控中的作用提供了依据。     

水稻AP2/EREBP转录因子响应非生物胁迫的表达谱分析

 【目的】了解AP2/EREBP家族基因参与逆境反应分子机理,为水稻抗逆相关基因的克隆及揭示水稻抗逆分子调控机理奠定基础。【方法】采用基因芯片技术分析AP2/EREBP家族基因在水稻幼苗受PEG、低温、高盐、ABA、GA等处理下的表达谱变化,并通过实时定量PCR技术对部分具有明显表达特点基因的胁迫表达谱进行验证。【结果】点制了水稻AP2/EREBP转录因子家族的基因芯片,检测到42个胁迫差异表达的AP2/EREBP基因。实时定量PCR所得结果与基因芯片结果基本吻合,说明芯片结果可靠。两个AP2/EREBP基因对所有胁迫反应相同,其它差异表达的AP2/EREBP基因对不同胁迫反应各不相同。【结论】研究发现两个AP2/EREBP基因在水稻应对外界胁迫反应中起核心分子调控作用;不同差异表达AP2/EREBP基因在水稻响应不同胁迫反应过程中具有相同或者不同的分子应答机理。     

水稻逆境响应基因OsMsr11的克隆与分析

为了挖掘新的耐逆基因,本文在应用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻亲本培矮64S在不同逆境(高温、干旱、低温)胁迫下、不同发育时期叶片和穗中全基因组表达模式的基础上,对其中一个多逆境响应基因OsMsr11(Oryza sativa L.multiple stressresponsive gene 11)进行了克隆与分析。OsMsr11是一个受低温、干旱、高温多逆境诱导的基因,在孕穗期低温胁迫下表达水平显著上调。通过PCR扩增获得了包含其完整开放阅读框的cDNA序列。序列分析表明,其ORF为234 bp,编码77个氨基酸,有信号肽序列,无典型的保守基因结构域,预测其为分泌通路信号肽,分泌到细胞周质中,功能未知;OsMsr11基因不含内含子,对其启动子区域进行分析,发现含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。为研究其功能,采用农杆菌侵染法转化超级稻父本9311,初步分析表明:在水稻中过量表达OsMsr11,增强了转基因水稻的耐盐性,降低了对外源ABA的敏感性。     

全基因组范围禾本科植物GPX基因家族的进化分析和表达模式研究

【目的】研究禾本科植物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因家族的序列及其在正常生长和胁迫条件下的表达差异,为揭示GPX基因在植物抵抗逆境胁迫中的作用奠定基础。【方法】利用生物信息学方法,分析水稻、短柄草、高粱中18个GPX基因的序列特点、基因结构和系统进化关系;采用反转录PCR(RT-PCR)方法,分析18个GPX基因在正常生长以及1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)、双氧水(H2O2)、莠去津(Atrazine)和水杨酸(SA)处理后,水稻、短柄草和高粱的根、茎、成熟叶、幼叶、叶鞘,以及正常生长条件下发芽2d后幼苗根和芽中的表达情况。【结果】从水稻、短柄草和高粱基因组中分别鉴定出6,5,7个GPX基因,这些基因编码长度为168~251个氨基酸的蛋白,分子质量介于18.44~27.42ku。系统发生分析发现,3个物种至少有7个最近的共同祖先GPX基因,物种分化之后水稻和短柄草分别丢失1个和2个GPX基因。序列相似性分析发现,3个物种GPX蛋白具有较高的序列相似性,介于38.0%~95.2%,且不同基因簇中GPX序列的分化速率不同。3个物种GPX基因具有保守的基因结构,但SbGPX7发生了内含子插入事件,预示着其与其他GPX基因之间功能的分化。表达模式分析发现,3个物种的18个GPX基因中有15个在所有检测样品中均为组成型表达,3个GPX基因(水稻2个、高粱1个)为选择性表达,表达模式的分化预示着功能的分化。【结论】作为植物保护细胞免受氧化损伤的重要酶类,禾本科3个物种的GPX基因在进化过程中发生了功能分化。     

一个水稻小G蛋白OsRan1的克隆及表达分析

逆境对于水稻产量和品质有很大影响,研究在逆境下水稻基因的表达变化对于研究水稻抗逆有着重要意义。运用荧光差异显示（Fluorescence Differential Display,FDD）技术,从低温处理的水稻中克隆到OsRAN1基因并通过半定量PT-PCR分析该基因在低温和高盐逆境下的表达。该基因cDNA序列全长为984bp,含有一个编码221个氨基酸残基的开放阅读框,推测分子量为25.0KD,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白Ran亚家族,通过氨基酸相似性比对发现,Ran家族氨基酸序列高度保守,OsRAN1与TaRAN1和AtRAN1相似性分别达到98.19%和92.76%。通过半定量PT-PCR分析,发现在低温胁迫下,OsRAN1在根和叶鞘中表达量均有增加,尤其是高盐胁迫下根中OsRAN1表达量有迅速升高然后降低的变化。推测该基因在水稻逆境应答中起着重要作用。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

水稻OsCER4基因启动子序列及表达分析

通过生物信息学方法对水稻(Oryza sativa L.)蜡质合成相关基因OsCER4启动子序列和表达特性进行了分析;通过构建OsCER4启动子驱动的GUS融合表达载体,分析了OsCER4基因的时空表达;并分别以200 mmol/L Na Cl、100μmol/L ABA和1.0%H2O2处理水稻幼苗,通过半定量RT-PCR分析逆境胁迫下OsCER4的表达模式。启动子序列分析表明,OsCER4启动子中包括大量根、茎、叶肉等特异表达位点以及与干旱、冷、盐等多种逆境胁迫相关的调控序列。表达特征分析表明,OsCER4基因在愈伤组织、根、茎、叶中均有表达,在颖壳和子房中也有表达。Na Cl和PEG等逆境胁迫下,OsCER4基因表达量在不同处理时间有所增加,H2O2胁迫下,OsCER4基因表达量有所下降。     

水稻多逆境响应新基因OsMsr9的表达与克隆

为发掘水稻新的耐逆基因,研究植物在应答逆境胁迫时的分子机制,我们采用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S全基因组在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一批表达水平显著改变的基因。其中基因OsMsr9(Oryza sativa L.Multiple Stresses Responsive Gene9,GenBank登录号为EU276058)的表达量在高温、低温、干旱处理后在多个组织器官、发育时期均有显著提高。实时定量PCR分析其特定时空表达量的结果与基因芯片的结果基本吻合。通过RT-PCR法,得到包含OsMsr9完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据生物信息学分析,该ORF编码一个包含168个氨基酸残基的蛋白质,与玉米(Zea mays)中含F-box结构域的全长蛋白有大约58%的相似性,而F-box蛋白可能与植物抗逆性有关。基于上述实验及分析结果,OsMsr9可能是一新的水稻耐逆功能基因。     

水通道蛋白基因OsPIP2;6的功能分析

【目的】分析水稻过表达OsPIP2;6在逆境胁迫条件下的表型差异,探讨水通道蛋白基因在水稻逆境应答中的作用。【方法】构建水稻水通道蛋白OsPIP2;6的过表达载体,通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,得到转基因植株。通过逆境胁迫下转基因植株的表型分析来探讨OsPIP2;6的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,OsPIP2;6受GA、ABA调控。转基因植株的OsPIP2;6表达量显著提高。正常条件下,转基因植株与野生型植株生长发育情况并无显著差异。在逆境胁迫条件下,转基因植株的耐受能力均显著强于野生型植株。【结论】过表达水稻水通道蛋白基因OsPIP2;6的转基因植株表型显示,OsPIP2;6在水稻的抗旱、抗水淹和抗盐中发挥作用。