猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及在疫苗评价中的应用(英文)

[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在102~1010拷贝/μl之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%~110%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,敏感性较高,而且特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3%,表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价,也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研究提供可靠的工具。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N基因,建立了PEDV的TaqMan探针RT-PCR检测方法。以标准质粒绘制log10拷贝数与Ct之间标准曲线的线性相关系数值为0.996,检测灵敏度为100拷贝/μL,对传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒2型等几种猪病毒的检测结果均为阴性,批内和批间的变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。对不同代次细胞培养上清中的病毒样品进行检测,结果表明该方法能够满足PEDV野毒株分离过程中的病毒定量检测需要。     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为100.4%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P0.05)高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法，本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针，通过优化PCR反应体系和反应条件，建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法，验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示：本研究所建立的检测方法特异性强，与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应；灵敏度高，能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好，组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑，为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测.     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查.     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

利用DNASta软软件对GeneBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因序列进行分析,选择保守区域设计合成引物和探针,制备M基因重组质粒标准品,建立检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果表明:建立的定量标准曲线Ct值和模板起始拷贝数对数在10~8—10~1copies/μL有良好的线性关系,相关系数R~2为0.997,该方法可检测到初始模板中6.368 copies/μL的质粒DNA;应用该方法检测49份临床样品,阳性率达98%,比普通RT-PCR方法检测的阳性率高18%。研究表明,建立的PEDV TaqMan荧光定量PCR检测方法具有较好的灵敏性、特异性和重复性,适用于临床样本中PEDV的快速检测,为PEDV的感染和增殖规律的研究奠定了基础。     

SYBR Green I实时定量PCR方法检测2型猪圆环病毒

利用PCR技术扩增出2型猪圆环病毒(PCV)ORF2保守区基因107 bp片段,并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。再以提取的PCV-2、PCV-1、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR检测。结果表明:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与样本阈值循环数(Ct)值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2为0.997,Ct值为11.9~26.9。PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于104拷贝.μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于105拷贝.μL-1。实时荧光定量PCR方法可用于2型猪圆环病毒定性及定量的检测。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy栽体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法...     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法。本研究根据GenBank中登录的PEDV和PCV3基因组序列,分别在M基因和Rep基因高度同源保守区设计2对特异性引物,建立了检测PEDV和PCV3双重PCR方法,即可同时扩增225bp(PEDV)和138bp(PCV3)2条特异性片段,而该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌核酸扩增均为阴性;PEDV和PCV3的最低检出量分别为428和325拷贝/μL,且特异性强、敏感性好,为快速、高效检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

鲜奶中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的定量PCR检测

为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反应,分析该方法的敏感性、特异性,并检测鲜奶样品以验证Taqman荧光定量PCR实用性和可靠性。结果表明,建立的定量PCR方法在1μl 1×101拷贝至1μl 1×106拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.996,扩增效率112%。该方法的检测灵敏度为1μl 70拷贝,敏感性较高,而且特异性良好,与其他血清型大肠杆菌、沙门氏杆菌和志贺氏菌等易混淆菌株核酸之间没有交叉反应。批间和批内检测的变异系数(RSD)低于2%,表明该方法重复性良好。     

猪附红细胞体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建一种快速、高效、灵敏的猪附红细胞体(M.suis)检测方法。本研究根据GenBank中的猪附红细胞体α-烯醇化酶(Eno)基因(序列号:AB265823.1),设计并合成了1对引物P5和P6,通过常规PCR方法对Eno基因中的一段序列进行扩增,并将其纯化后的PCR产物克隆入pMD-18T载体中,从而构建重组质粒。以阳性重组质粒为模板,建立了猪附红细胞体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。在1.44×10~6~1.44×10~2拷贝/μL范围内具有较好的线性关系,相关系数R~2=0.965,检测到的浓度下限为1.44拷贝/μL。特异性试验中仅对猪附红细胞体的检测结果呈阳性,而对猪肺炎支原体、弓形虫、猪链球菌、猪呼吸与繁殖综合征病毒的检测结果均呈阴性。重复性试验结果表明,其组内和组间变异系数均小于2.0%。用该检测方法对49份猪附红细胞体疑似血液样品进行检测,所建立的荧光定量PCR方法检测的阳性率为40.8%(20/49),高出常规PCR方法检测的阳性率1.33倍。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的成功建立,为猪附红细胞体感染的早期诊断及定量分析提供了可靠依据。     

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）,是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26     

禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)~(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。     

猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪呕吐、腹泻和脱水,各年龄段的猪均可发病,而哺乳仔猪发病和死亡最为严重。2010年末发生的仔猪腹泻综合征的主要病原为PEDV变异株。根据PEDV变异株S基因发生碱基缺失和插入的特征设计并合成了1对特异性引物,首次建立了PEDV变异株的RT-PCR检测方法。结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,不和PEDV经典毒株反应,也不与其他动物病原反应;敏感性较高,最低可检测10~(-3)ng/μL,且重复性较好。用该方法对2013—2014年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果发现109份样品(34.3%)为PEDV变异株阳性,表明我国腹泻猪群中PEDV变异株感染较为普遍。本研究建立的PCR方法可以作为PEDV变异株在临床上的一种鉴别诊断技术。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。