百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白抗血清制备及其与同属BYDVs的血清学关系

 大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses, BYDVs)属于黄症病毒科,主要以蚜虫为介体进行传播,引发多种作物减产或绝收。本文将BYDV-PAV青海分离物的运动蛋白(MP)克隆到原核表达载体pDB-MBP-His上,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下表达蛋白分子量约为61 kDa的融合蛋白。将纯化后的蛋白作为抗原免疫‘新西兰’大白兔制备抗血清,Western blot检测本生烟瞬时表达带标签的MP蛋白,结果显示该抗血清效价为1∶32 000,灵敏度达1∶256,且该抗血清可与相差34个氨基酸的PAV015株系以及隶属于黄症病毒属其他的BYDVs(PAS、MAV、KerⅡ和KerⅢ)MP均能发生强烈的血清学反应,具有血清学相关性。本研究制备的大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白多克隆抗体为探索BYDV-PAV运动蛋白的功能以及作用机制打下了基础。     

辣椒轻斑驳病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。     

抑制南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白P5-1的表达阻碍病毒在昆虫体内的增殖

为明确南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)编码的非结构蛋白P5-1参于SRBSDV在介体白背飞虱体内侵染过程中的作用机制,通过原核表达蛋白制备SRBSDV编码的非结构蛋白P5-1的多克隆抗体,并应用Western blot和免疫荧光标记法检测抗体的特异性,以注射法将来源于P5-1基因的dsRNA(ds P5-1)注入获毒1 d的白背飞虱体内,5 d后通过免疫荧光标记法检测ds P5-1对SRBSDV在白背飞虱体内增殖的影响,同时以注射来源于GFP基因的dsRNA(ds GFP)为对照。结果显示,Western blot和免疫荧光标记分别检测到SRBSDV侵染水稻和白背飞虱表达的P5-1蛋白,表明所制备的P5-1抗体具有特异性。ds GFP处理的对照组白背飞虱带毒率高达81%,而ds P5-1处理的白背飞虱带毒率仅为21%,且P5-1蛋白的表达和SRBSDV在昆虫体内的增殖均受到抑制。表明P5-1蛋白是病毒在昆虫体内增殖的关键因子,可作为阻断病毒在昆虫体内增殖的理想靶标。     

香蕉苞片花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。     

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

 根据已报道的大麦黄矮病毒GPV株系(BYDV-GPV)相关基因序列设计合成引物,利用RT-PCR方法获得ORF4基因,并将其克隆到原核表达载体pET-5a中。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析,结果表明:ORF4基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中获得了高效表达,分子量为17 kDa。以回收的表达产物为抗原免疫家兔,制备了BYDV-GPV 17kDa蛋白的特异性抗血清。Western blot检测结果,制备的抗血清可用于检测BYDV-GPV侵染后在燕麦体内表达的17 kDa蛋白。     

泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗血清的制备及应用

 根据报道的泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’-broom phytoplasma,PaWB)抗原膜蛋白(antigenic membrane pro-tein,AMP)基因的核苷酸序列设计引物,提取发病泡桐总DNA,经PCR扩增并成功克隆泡桐丛枝植原体amp基因。序列分析表明,amp基因由696个核苷酸组成,编码231个氨基酸残基,与GenBank中登录的2个泡桐丛枝植原体的膜蛋白核苷酸序列同源性为100%。将amp基因91-604 nt部分序列(命名为ampd)克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,诱导后,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表明融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以纯化的带GST标签的AMPD融合蛋白为抗原免疫德国大白兔,制备了PaWB-AMPD抗血清。利用该血清,通过Western印迹、点印迹、ELISA、间接免疫荧光和免疫捕获PCR试验均能在发病泡桐组织中特异检测到泡桐丛枝植原体。     

白草花叶病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 将白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus,PenMV)的外壳蛋白(CP)基因连接到表达载体pET22b (+)上,获得重组子pET-PCP。SDS-PAGE和Western blotting分析表明,经IPTG诱导后,含pET-PCP的大肠杆菌BL21(DE3) pLys产生分子量为36 kDa的融合蛋白。以Ni²⁺亲和层析柱纯化该蛋白,并以其为抗原免疫德国大白兔制备了特异性较强的抗血清。微量免疫沉淀法测其效价为1:1 024,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1:8 192。该血清可替代常规病毒粒子所制备的抗血清,用于检测PenMV。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅱ基因的克隆、原核表达与抗血清制备

 用CTAB法从感染草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus, SVBV）的草莓叶片中提取总DNA,设计特异性引物扩增SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因,克隆并测序。结果表明,SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因全长486 nts,编码161个氨基酸。将其与SVBV美国分离物以及花椰菜花叶病毒属其他成员的ORF Ⅱ基因相比较,结果表明,SVBV中国分离物 ORF Ⅱ基因与SVBV美国分离物的核苷酸序列相似性最高,达91.2%。将SVBV ORF Ⅱ基因插入原核表达载体pET32a（+）,重组质粒pET-ORF Ⅱ转化大肠杆菌BL21（DE3）。经IPTG诱导及Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为38 kDa的融合蛋白。以此纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,可以制备出高效价的抗血清。Western blot分析表明,制备的抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应。利用抗血清进行ELISA测定,能够检测出感病草莓植株病汁液中SVBV ORF Ⅱ基因表达的蛋白。     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

The total DNA was extracted from strawberry leaves infected with Strawberry vein banding virus (SVBV) by CTAB method. Specific primer pairs were designed to amplify the gene ORF I of SVBV-Shenyang isolate by PCR, gene ORF I was cloned into modified prokaryotic expression vector pET-32a (+)-GST, the recombinant plasmid pET-ORF I was transformed into E. coli DH5α, then the positive clones were screened and sequenced. The recombinant plasmid was extracted and transformed into Escherichia coli BL2l (DE3), the fusion protein with an approximate molecular weight of 56 kDa was obtained with IPTG induction and Ni²⁺-NTA affinity column purification. The purified fusion protein was used to immunize the rabbits to prepare the specific antiserum. The result of ELISA showed that the titer of the prepared antiserum is up to 1:520 000, Western blot analysis indicated that the prepared antiserum could reacted specifically with purified recombinant fusion protein. Not only the expression of P1 protein in SVBV infected-strawberry leaves, but also the expression of P1 protein in P1-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves could be detected, using 2 000 times diluted antiserum.     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

<正>草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)是一种世界范围内广泛分布的草莓病毒,SVBV侵染栽培草莓(Fragaria ananassa)可造成植株生长衰弱,匍匐茎数量减少、果实偏小,产量和品质大幅度降低[1]。SVBV属于花椰菜花叶病毒科(Caulimovidae)花椰菜花叶病毒属(Caulimo-virus)。花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)是C     

菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒EP-1-like基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备方法

本实验提取被菜蛾盘绒茧蜂寄生后24h的小菜蛾幼虫体内总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板PCR扩增出菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesia vestalis polydnavirus,CvBV)EP-1-like基因,将其分别克隆到表达载体pET30a、pET28a中,转化宿主菌BL21(DE3),获得单克隆重组质粒pET-30a-EP1L和pET-28a-EP1L。经IPTG诱导,pET-28a-EP1L成功表达了约34.8kDa的包涵体蛋白。将诱导条件优化以后,采用割胶回收的方法纯化包涵体,将纯化后的表达蛋白免疫新西兰大耳兔制备多克隆抗体。ELISA分析表明制备的抗体效价达1:128000,Western blot检测证明抗体具有良好的免疫反应特异性。     

香蕉线条病毒ORFⅡ基因的原核表达及抗体制备

 ORFⅡ gene of Banana streak virus GuangDong isolate (BSV-GD) was amplified from a BSV-GD recombinant plasmid by PCR, and the gene was expressed by being cloned into prokaryote expression vector pET-28b (+). The fusion protein was about 16.5 kDa in size and was soluble with SDS-PAGE analysis. The purified protein was obtained by using the histidine labeling kit of N-terminus of protein. The antiserum was obtained by immunizing healthy rabbits with the purified protein. Western blot and ELISA analysis showed that the special antiserum of BSV possessed high titer, which was tested as 1:51 200. The study was a base for further research on BSV including ORFⅡ gene function and virus detection.     

葡萄A病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备

 葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）为线性病毒科（Flexiviridae）葡萄病毒属（Vitivirus）的代表种,是葡萄皱木复合病（rugose wood complex disease）的重要病原之一,可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等危害\[1,2\]。GVA为线状单链RNA病毒,基因组共编码5个开放阅读框（ORF1\|5）,其中ORF4 编码外壳蛋白（coat protein, CP）,是病毒粒子包裹和系统移动所必需的功能蛋白\[3,4\]。GVA自然寄主为葡萄,机械摩擦可侵染本氏烟等草本寄主\[2\],由于嫁接和无性繁殖材料调运等因素造成该病毒远距离传播,目前在世界多个国家和地区均有发生。     

芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及P3蛋白抗血清的制备

 用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒( Turnip mosaic virus,TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%~99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%~99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。     

甜瓜黄斑病毒外壳蛋白的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

本研究将甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)外壳蛋白基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中,利用大肠杆菌系统表达该蛋白,免疫家兔制备其多克隆抗体。本文通过多克隆抗体,建立了间接ELISA(ID-ELISA)、免疫捕获PCR(IC-RT-PCR)、Western blot及dot-ELISA的MYSV检测方法,以上各种方法均能特异的检测MYSV。检测结果表明:ID-ELISA方法检测效价大于1∶6 400;Western blot检测灵敏度达到1∶320(W/V,g·mL-1);Dot-ELISA检测灵敏度达到1∶80(W/V,g·mL-1),且用牙签等非实验室工具便能检测该病毒,能高效地应用于田间样品的检测。     

樱桃病毒A北京分离物外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

根据前期研究获得的樱桃病毒A北京分离物(Cherry virus Aisolate Beijing,CVA-BJ)外壳蛋白基因序列设计引物,将此基因克隆到原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。Ni珠吸附法纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。间接ELISA测得抗血清效价为1∶2048。以纯化后的蛋白和樱桃叶片总蛋白为检测材料,Western blot分析表明抗血清具有高度特异性。间接ELISA方法检测樱桃病叶,结果呈阳性,与RT-PCR检测结果一致。表明制备的抗血清可用于感病樱桃样品中CVA的检测。