一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌的快速分子检测

大丽轮枝菌Verticillium dahliae是引起棉花黄萎病的土传病害病原真菌。快速及时地检测出大丽轮枝菌,对棉花黄萎病的早期预警及后期防治具有重要意义。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术对已报道大丽轮枝菌的检测引物进行验证、筛选和改进,获得1对改进的特异性PCR引物VDS-F/VDS-R。在优化的反应体系与扩增条件下,能特异性地从大丽轮枝菌基因组扩增出l条约520 bp的产物条带,检测灵敏度达到10~(-2)ng/μL;利用该引物可特异性地从含有大丽轮枝菌的土壤及棉花植株组织中检测出病原菌;采用巢氏PCR法对人工病土的检测灵敏度达到了10个孢子/g土。表明本引物的PCR检测体系可用于棉花黄萎病的早期快速检测。     

棉秆生物炭对大丽轮枝菌生长及毒素作用的影响

棉花黄萎病难以防治的根源在于大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb在土壤中形成的微菌核能抵抗不良环境,并在土壤中长期存活,将棉秆加工成生物炭施入棉田,可克服棉秆直接还田的缺点,从源头上防止黄萎病菌进入土壤。为探索棉秆生物炭还田对棉花黄萎病原菌的影响机理,采用液态摇床培养及平皿固态培养法研究生物炭对大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核萌发的影响;通过平皿内棉花和甜瓜种子发芽试验研究生物炭对大丽轮枝菌毒素的减毒作用。结果表明:液态培养条件下,棉秆生物炭对大丽轮枝菌菌丝生长抑制作用不明显,在固态培养下对菌丝体生长有一定促进作用;生物炭能减慢微菌核的萌发速率,但对最终萌发率无影响;液态培养中加入棉秆生物碳对大丽轮枝菌毒素有较强的减毒作用。在摇床培养中期,加入2.0 g·L-1生物炭处理与对照棉种在培养12天时的发芽率分别为53.3%与33.3%(P0.05);前期、中期及后期加入0.5 g·L-1生物炭处理的棉花幼苗总长度分别为对照的4.9、2.1倍及3.2倍;加入棉秆生物碳处理甜瓜种子发芽率、胚根长度、胚轴长度及总苗长较对照均有不同程度增加。表明棉杆生物炭对棉花黄萎病菌大丽轮枝菌菌丝生长、微菌核萌发的抑制作用较弱,对大丽轮枝菌毒素危害有较强的减毒作用。     

一种新的棉花黄萎病快速接种技术及其在病原菌致病力和寄主抗病性鉴定上的应用

 棉花品种抗黄萎病鉴定一般在田间病圃中进行,其结果受病圃中病原菌分布均匀程度、气象等因素影响极大,往往导致鉴定结果不准确。为了使鉴定方法简单、科学、可靠,我们在温室条件下比较了3种苗期接种棉花黄萎病的方法,即切根蘸孢子法(接种浓度为10⁶分生孢子/mL);菌培养物土壤接种法(0.5%、1%、2%,w/w);微菌核土壤接种法(10³个微菌核/g土)。结果表明,切根蘸孢子法导致棉苗发病均匀、严重、迅速,播种35~45 d后即可得到均匀一致的发病结果。而其它2种接种方法在播种75 d后才得到相对稳定的发病结果。同时,研究还表明接种浓度为10⁴分生孢子/mL所导致的黄萎病显著比10⁵或10⁶的轻。利用切根蘸孢子法在室内鉴定12个棉花品种或品系的抗黄萎病能力,证明该方法是抗黄萎病快速鉴定的有效方法。此外,该鉴定方法还可快速鉴定黄萎病菌不同菌株的致病性,并可应用于作物对其它土传病害的抗病性鉴定上。     

大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的特异扩增

 根据棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)核糖体基因ITS区段的碱基编码序列,设计合成了1对为26 bp的PCR特异扩增引物(引物1:5'CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG,和引物2:3'CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA),进行了大丽轮枝病菌PCR特异扩增试验。试验结果表明:本试验设计合成的这对引物,能对大丽轮枝菌全基因组DNA和人工接种棉花黄萎病病株组织特异地扩增到大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的324 bp分子片段,该对引物可用于棉花黄萎病的分子鉴定和分子监测。本试验结果对棉花黄萎病的早期诊断和病原菌的检测和监测有潜在的应用价值。     

大丽轮枝菌效应蛋白VdSRP2的功能分析

为明确效应蛋白VdSRP2在大丽轮枝菌Verticillium dahliae中的生物学功能,从大丽轮枝菌落叶型菌株V592中克隆VdSRP2基因并进行生物信息学分析,利用酵母转化酶分泌系统对其信号肽活性进行测定,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术分析VdSRP2基因在大丽轮枝菌中的表达模式,并以V592菌株为材料获得VdSRP2基因的敲除突变体和过表达体菌株,通过表型分析和致病性测定确定VdSRP2基因的生物学功能。结果显示,VdSRP2基因编码232个氨基酸,含有5个半胱氨酸残基,N-端信号肽具有分泌活性,为真菌的典型效应蛋白;VdSRP2基因主要在大丽轮枝菌菌丝和微菌核中表达,其中经棉花根系诱导培养24 h时表达量最高;与野生型菌株V592相比,VdSRP2基因敲除导致大丽轮枝菌的产孢量和孢子萌发率显著下降,不能形成微菌核,对棉花的致病力明显减弱;但VdSRP2基因敲除不影响大丽轮枝菌的穿透能力;VdSRP2基因在本氏烟和棉花叶片瞬时表达不会诱导细胞死亡。表明VdSRP2是大丽轮枝菌微菌核形成必需...     

北疆棉花黄萎病发病率调查及土壤中黄萎病菌微菌核数量与种群类型分析

为了解北疆棉花黄萎病的发生情况及发病与土壤中黄萎病菌微菌核数量的关系和病原菌种群类型, 2021年对北疆石河子?奎屯?博乐等8市(县)棉田棉花黄萎病发病率?土壤中黄萎病菌的微菌核数量?菌株种群类型进行了抽样调查?结果表明, 北疆未发生棉花黄萎病的棉田占49.2%, 0%<发病率<5.0%的棉田占32.7%, 发病率≥5.0%的棉田占18%?与2013年?2015年相比, 2021年无病田率分别增加17.7和12.7百分点, 发病率≥5%的棉田分别减少15.7和21.6百分点?从棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的关系来看, 整体上北疆棉田棉花黄萎病发病率与微菌核数量相关性不显著(r=0.119 1); 分区域看, 石河子-沙湾片区?奎屯-乌苏片区?精河-博乐片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数分别为0.033 2?0.007 6?0.062 3, 均无显著相关性; 而呼图壁-玛纳斯片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数为0.635 7, 呈中度正相关?土壤中的黄萎病菌菌株以菌核型为主, 占57.9%, 菌丝型占23.2%, 中间型占18.9%?用特异性引物进行PCR检测表明, 土壤中黄萎病菌落叶型菌株占97.6%, 占绝对优势?本研究将为北疆棉区棉花黄萎病的综合防控提供理论依据?     

基质中添加西兰花残体对大丽轮枝菌GFP标记菌株在棉花体内扩展的影响

 由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是一种难以防治的土传病害,西兰花残体还对其有一定的防治作用,防效为62.82%。为解析西兰花残体对棉花黄萎病的防治机制,本研究通过土壤杆菌转化的方法构建了大丽轮枝菌的绿色荧光标记菌株,采用共聚焦显微镜观察标记菌株在添加西兰花残体营养基质中和空白对照营养基质种植的棉花体内的侵染和扩展情况。结果表明构建的标记菌株gfp-wx-1与野生菌株wx-1的生物学特性无显著性差异。同时发现大丽轮枝菌在添加西兰花残体营养基质中棉花体内扩展较慢,具体表现为:在空白营养基质种植的棉花体内,大丽轮枝菌在接种第2 d时就可侵染根尖表层及根内部,第3 d到达茎部维管束,第5 d叶片可观察到少量病原菌,第7 d第一片子叶呈现大量病原菌,后期迅速扩展,叶片出现黄萎病斑;而在营养基质中添加西兰花残体种植的棉花体内,大丽轮枝菌在接种第2 d时就可侵染根尖表层,第3 d侵染根尖内部,第5 d侵染茎部维管束,直到第7 d第一片子叶才出现少量病原菌,后期扩展慢,叶片病斑较少。本研究通过荧光定量PCR方法检测了大丽轮枝菌在两个处理棉花根部定殖情况,结果表明西兰花残体能够显著降低大丽轮枝菌在棉花根部定殖的量。该研究初步明确了西兰花残体对棉花黄萎病的防治机制,为棉花黄萎病的绿色防治提供了一条新的途径。     

拮抗性链霉菌对大丽轮枝菌微菌核形成与萌发的影响

为探索拮抗性链霉菌对棉花黄萎病病原大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.的抑菌机制,采用菌丝生长速率法、微菌核萌发法研究了6株拮抗链霉菌无菌发酵滤液对大丽轮枝菌生长、微菌核形成与萌发的影响。链霉菌无菌发酵滤液对大丽轮枝菌菌落生长、菌核形成和微菌核萌发有明显抑制作用。其中菌株B49的抑菌效果最好,5倍稀释发酵液培养14天时对菌落生长的抑菌率达69.7%;菌株B49、D184和Act12的5倍稀释发酵液对微菌核形成的抑制率达100%;将经B49、D184和Act12发酵液处理后丧失形成微菌核能力的大丽轮枝菌菌株转接至不含发酵液的PDA培养基,连续传代至第5代,其仍然不能恢复形成微菌核的能力;微菌核在含有菌株D184 5倍稀释发酵液的培养基上培养168 h时,萌发率仅为38.3%。     

Development of an assay for rapid detection and quantification of Verticillium dahliae in soil

ABSTRACT Verticillium dahliae is responsible for Verticillium wilt on a wide range of hosts, including strawberry, on which low soil inoculum densities can cause significant crop loss. Determination of inoculum density is currently done by soil plating but this can take 6 to 8 weeks to complete and delay the grower's ability to make planting decisions. To provide a faster means for estimating pathogen populations in the soil, a multiplexed TaqMan real-time polymerase chain reaction (PCR) assay based on the ribosomal DNA (rDNA) intergenic spacer (IGS) was developed for V. dahliae. The assay was specific for V. dahliae and included an internal control for evaluation of inhibition due to the presence of PCR inhibitors in DNA extracted from soil samples. An excellent correlation was observed in regression analysis (R(2) = 0.96) between real-time PCR results and inoculum densities determined by soil plating in a range of field soils with pathogen densities as low as 1 to 2 microsclerotia/g of soil. Variation in copy number of the rDNA was also evaluated among isolates by SYBR Green real-time PCR amplification of the V. dahliae-specific amplicon compared with amplification of several single-copy genes and was estimated to range from ≈24 to 73 copies per haploid genome, which translated into possible differences in results among isolates of ≈1.8 cycle thresholds. Analysis of the variation in results of V. dahliae quantification among extractions of the same soil sample indicated that assaying four replicate DNA extractions for each field sample would provide accurate results. A TaqMan assay also was developed to help identify colonies of V. tricorpus on soil plates.     

大丽轮枝菌及激素处理后棉花酵母双杂交文库的构建

大丽轮枝菌是引起棉花、马铃薯等重要作物黄萎病的土传病原真菌,其分泌的胞外蛋白是侵染寄主的重要毒力因子,因此研究胞外蛋白与寄主的相互作用具有重要意义.本研究旨在构建高效的棉花酵母双杂交cDNA文库,并通过已知大丽轮枝菌效应子VCR1互作蛋白的筛选来评价构建文库的质量.分别采用大丽轮枝菌及茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯处理海岛棉...     

韭菜等几种植物根系分泌物对棉花黄萎病菌的影响

通过水培法收集韭菜、大葱、野薄荷、藿香和薰衣草的根系分泌物,研究其对大丽轮枝菌菌丝生长、孢子萌发的影响,并通过室内盆栽试验研究了植物根系分泌物对大丽轮枝菌微菌核萌发的影响。结果表明,5种植物根系分泌物对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发均表现为抑制作用;随着浓度的升高,抑制作用增强,而在同一浓度下,随着处理时间的延长,根系分泌物对孢子萌发的抑制作用逐渐减弱。盆栽试验表明,植物根系分泌物对大丽轮枝菌微菌核的萌发均表现为抑制作用,且微菌核对韭菜根系分泌物最为敏感。5种植物中,韭菜根系分泌物的抑制作用最强,野薄荷次之,藿香最弱。     

Mechanism of broccoli-mediated verticillium wilt reduction in cauliflower

ABSTRACT Broccoli is resistant to Verticillium dahliae infection and does not express wilt symptoms. Incorporation of broccoli residues reduces soil populations of V. dahliae. The effects of broccoli residue were tested on the colonization of roots by V. dahliae, plant growth response, and disease incidence of both broccoli and cauliflower in soils with different levels of V. dahliae inoculum and with or without fresh broccoli residue amendments. The three soils included a low-Verticillium soil, a high-Verticillium soil, and a broccoli-rotation soil (soil from a field after two broccoli crops) with an average of 13, 38, and below-detectable levels of microsclerotia per g of soil, respectively. Cauliflower plants in broccoli-amended high-Verticillium soil had significantly (P 相似文献   

利用微生物杀菌剂防治马铃薯黄萎病

马铃薯黄萎病是一种重要的世界性土传兼种传维管束病害,危害大且防治困难。利用活体微生物杀菌剂是防治作物土传病害的有效措施之一。本研究通过盆栽试验评价了微生物杀菌剂枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对马铃薯出苗和生长的安全性,在河北省马铃薯主产区开展田间小区试验,研究了该制剂有效防治马铃薯黄萎病的使用方法和适宜施用剂量,并在河北省涞源县、围场县和永年区3县区分别开展了田间示范应用。盆栽试验和田间试验结果表明,枯草芽胞杆菌可湿性粉剂15、30和45 kg/hm²拌种处理对马铃薯出苗安全,对马铃薯生长没有不良影响;田间小区试验表明,在围场县试验田中,该制剂30 kg/hm²拌种处理单独使用或30 kg/hm²拌种加15 kg/hm²初花期滴灌使用均能显著减轻马铃薯黄萎病的发生,分别增产15.53%和17.10%;在新乐市试验田,枯草芽胞杆菌可湿性粉剂30 kg/hm²拌种处理显著增加马铃薯产量16.38%。田间示范应用结果表明,枯草芽胞杆菌可湿性粉剂30 kg/hm²拌种处理在涞源县和围场县防治马铃薯黄萎病效果显著,防效分别为84.22%和72.93%,两地分别显著增产24.30%和9.27%;在邯郸市永年区,相比化学药剂对照处理,枯草芽胞杆菌可湿性粉剂30 kg/hm²拌种处理显著增加马铃薯产量19.73%。本研究表明,枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对马铃薯黄萎病具有显著的防治效果和显著的增产效果,为该制剂在马铃薯生产中高效应用提供了科学依据。     

Control of <Emphasis Type="Italic">Verticillium dahliae</Emphasis> at a strawberry nursery by paddy-upland rotation

Effects of crop rotation between rice paddy fields and strawberry nurseries on the control of Verticillium wilt of strawberry were studied. For detecting Verticillium dahliae, the causal agent of Verticillium wilt, in soil, eggplant was used as an indicator plant. We were thus able to detect as low as 1 microsclerotium/g dry soil. In field surveys of Chiba and Hokkaido from 2000 to 2003, V. dahliae was detected in 9 of 10 upland fields but in none of 21 paddy-upland fields. In Hokkaido during 2000–2007, strawberry mother plants were planted, and plantlets were produced in upland and paddy-upland fields to assess V. dahliae infestation. Verticillium wilt of strawberry had never occurred in 72 tested paddy-upland fields, compared to 13.2–73.9% of plantlets infected with V. dahliae in upland fields. In a pot experiment in a greenhouse, two flooding treatments or two paddy rice cultivations suppressed Verticillium wilt symptoms on eggplant. In field experiments, one paddy rice cultivation in Chiba and two in Hokkaido prevented development of Verticillium wilt symptoms on eggplant. Verticillium wilt of strawberry was controlled completely with one paddy rice cultivation in infested fields in Chiba. In these field experiments, the number of microsclerotia of V. dahliae decreased under the flooding conditions for paddy rice cultivation. Based on the reduction in microsclerotia, a crop rotation system with paddy rice for 3 years (three times), green manure for 1 year, and strawberry nursery for 1 year was designed for Hokkaido.     

新疆榆树黄萎病病原菌鉴定

2013年以来,在石河子大学农学院试验站榆树苗上,出现了一种病害,可导致叶片褪绿,变黄,萎蔫,甚至枯死,剖茎检查可见维管束变成褐色。采用常规组织分离法对病茎组织进行分离、纯化获得单孢纯培养菌株;通过常规纸钵撕底蘸根法对其进行致病性测定;用形态学和rDNA-ITS序列分析方法对病原菌进行鉴定。结果表明,分离菌株的菌落形态、分生孢子梗和分生孢子的形态都与大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)一致;经分子生物学鉴定,该菌的rDNA-ITS序列与中国棉花黄萎病菌(V.dahliae)的ITS序列(登录号EU 835817.1)相似性达99.0%,故将引起新疆榆树黄萎病的病原菌鉴定为大丽轮枝菌(V.dahliae)。