昆明系小鼠饲养层细胞制备条件的优化

通过分离不同胚龄的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),对MEF进行连续传代培养,并对MEF不同的消化时间进行探讨,研究影响小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养的因素.结果表明,分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄是12.5 d～14.5 d;37℃条件下,用2.5 g/L胰蛋白酶作用PMEF,作用时间不应超过15min;离散贴壁的成纤维细胞,作用时间以2 min～3 min为宜;MEF在第2代～第5代增殖旺盛,7代以后细胞出现急剧下降.所以选择第3代MEF是制做饲养层的最佳时机.MEF分离方法简单,来源方便,增殖迅速,是用于胚胎干细胞分离培养的有效培养体系.     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

<正>目的:探索不同浓度的丝裂霉素C(MMC)处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法:取13.5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3.5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论:胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

目的：探索不同浓度的丝裂霉素c（MMC）处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法：取13．5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论：胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;MMC能有效抑制胎儿成纤维细胞的增殖,最佳处理方法为20μg／ml、2h。妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在10、20μg／mlMMC处理的饲养层上孵出率和贴壁率显著高于5／Lg／mlMMC处理的饲养层,在5、10和20μg／m[MMC处理的饲养层上,内细胞团增殖率无显著差异。因此,ICR小鼠胚胎成纤维细胞最佳处理方法为20μg／mlMMC作用2h。     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

<正>目的:探索不同浓度的丝裂霉素C(MMC)处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法:取13.5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3.5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度     

MTS和CCK-8法检测番鸭胚胎成纤维细胞增殖的比较

为探讨MTS法和CCK-8法检测番鸭胚胎成纤维细胞增殖的最佳试验条件,以12~13日胚龄番鸭鸭胚作为胚胎成纤维细胞原代培养的细胞来源,利用传至F2代的胚胎成纤维细胞为研究对象,对比MTS法和CCK-8法在不同孵育时间及不同检测波长条件下吸光光度值的差异,研究MTS法和CCK-8法检测番鸭胚胎成纤维细胞增殖活性的最佳检测时间、最佳检测波长,根据细胞数量与OD值的关系曲线确定两种试剂各自的最适细胞浓度。结果表明:MTS法的最佳波长为492 nm、CCK-8法为450 nm,MTS法的灵敏度稍高于CCK-8法;两种方法的最佳检测时间均为加入试剂后4 h;MTS法的最适细胞接种浓度为1.25×103~1×104个/mL,CCK-8法为2.5×103~1×104个/mL。MTS和CCK-8法均能较好地检测番鸭F2代胚胎成纤维细胞的体外增殖情况,相对于CCK-8法,MTS法更加经济,灵敏度更高。     

影响制备小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的因素

为了建立活力稳定高效的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层,实验以13.5~14.5 d的ICR小鼠胚胎为实验材料,以MTT法测定细胞活力,探讨了用丝裂霉素C处理MEF后,含有不同浓度胎牛血清的培养基对MEF活力的影响,以及不同传代次数的MEF对其活力的影响。结果表明:用含10%的胎牛血清培养液培养丝裂霉素C处理后的MEF,其活力比含2%、5%、20%的FBS培养液稳定。对不同传代次数的MEF进行处理后,第1、3代的MEF活力比第5、7代的MEF活力稳定。结论:用丝裂霉素C处理第1到第3代的MEF,以10%的胎牛血清培养液培养能得到活力稳定高效的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外培养条件初步研究

本研究旨在探索影响小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)分离培养的因素,建立有效的胚胎成纤维细胞培养体系,为构建饲养层细胞与体细胞核移植技术的细胞核供体建立平台。本研究用组织细胞培养液DMEM作为基础培养液,观察了不同胎龄、不同血清浓度及不同胰蛋白酶作用时间等因素对MEF分离培养的影响。结果显示,在所进行的4个胎龄8.5、10.5、12.5、14.5 d的比较试验中,原代成纤维细胞分离培养的最适胎龄为12.5 d,细胞贴壁迅速,12 h已完全贴壁,增殖速度快;在所进行的不同时间5、10、15、30 min的胰蛋白酶消化中,最佳时间为5~10 min;在所进行的5个血清浓度7%、9%、10%、11%、13%的比较试验中,添加11%胎牛血清浓度培养效果最佳,从3~5代增殖倍数稳定在1.35左右,传代时间也相对较长。以上结果表明,采用12.5 d胎鼠,胰蛋白酶消化5~10 min,在含有11%血清的DMEM培养液中培养MEF细胞时,原代和传代效果最好,传代至第3~5代时细胞生长增殖最旺盛,处于对数分裂期,适宜作为饲养层细胞与体细胞核移植细胞核供体。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和饲养层细胞的制备

通过实验确定分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄,探讨小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的效果及其寿命。结果表明,从１０ 、１１ ｄ 小鼠胚胎所获的胚胎成纤维细胞中混有大量神经母细胞和红细胞;用１４ 、１５ ｄ 的胚胎则基本不能获得胚胎成纤维细胞;消化３ ～４ 个１２ ～１３ ｄ 胚胎所获细胞悬液可接种８～９ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。从一只孕鼠的所有胚胎所获的成纤维细胞可接种约２０ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。所获细胞悬液的活细胞百分率可达９０％ ,接种成活率达８５ ％ 。胚胎成纤维细胞贴壁时间为５～６ ｈ ,１２ ｈ 后进入增殖期,４８ ｈ 形成细胞单层。ＥＳ细胞克隆在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上形态典型、增殖迅速、不分化。饲养层寿命可维持２ ～３ 周。     

昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化

以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。     

鸭胚成纤维细胞培养、传代及保存方法的研究

本研究旨在建立鸭胚成纤维细胞离体培养、传代以及冷冻保存体系,为鸭胚胎或生殖干细胞的离体培养奠定基础。利用胰酶-EDTA消化鸭胚胎组织,10% FBS+DEME营养液培养,获得原代和传代成纤维细胞。分别用DMSO、甘油以及乙二醇作为冷冻保护剂对F1代鸭胚成纤维细胞进行冷冻保存,检测复苏后细胞的生长情况。利用此方法可以获得高活性的鸭胚成纤维细胞,并可成功传至第三代。其中F1代与F2代细胞活力最好,达到90%以上。3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与F1代细胞的活力存在明显差异,均小于80%,其中用DMSO冷冻保存的细胞复苏后活力最强,生长密度保持较好。     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5~13.5 d ICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响。结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均比含15%KSR、5%FBS+10%KSR的细胞培养液高(42.9%,28.6%;75.0%,54.2%),ES细胞最高传至6代;培养液中添加10 ng/mL LIF+10 ng/mL SCF的效果比单独添加1种因子的效果好,最高传至6代,高于单独添加1种因子的传代数(4代,2代);用3种传代方法进行传代时,采用差异贴壁法传代效果最佳,最高传至8代,酶消化法传至4代,机械加酶消化法传至6代。     

长春新碱对天祝白牦牛胚胎成纤维细胞的作用

目的：探讨长春新碱对天祝白牦牛胚胎成纤维细胞生长的抑制作用,并用碱性磷酸酶指标判断天祝白牦牛胚胎成纤维细胞在长春新碱作用下去分化的可能性。方法：选取白牦牛胚胎成纤维细胞生长良好的24孔培养板,分别滴加浓度依次为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL长春新碱,每天在倒置相差显微镜下观察不同浓度的长春新碱对细胞形态的作用,并进行碱性磷酸酶染色检测。结果：适量浓度的长春新碱可以使细胞的形态发生变化（细胞变圆）,而且在去除长春新碱后,细胞能正常生长。高浓度的长春新碱会使细胞死亡崩解。长春新碱并不能使白牦牛胚胎成纤维细胞中的碱性磷酸酶浓度增高。结论：长春新碱浓度为0.5μg/mL时,对白牦牛胚胎成纤维细胞的抑制作用最佳,但是它并不能使细胞中碱性磷酸酶的含量增高。     

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。     

小鼠精原干细胞体外培养体系建立及功能鉴定

旨在通过探索ICR品系小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的体外稳定培养,为别的品系小鼠和大动物的SSCs体外培养提供参考.本研究采集6?8日龄ICR乳鼠的睾丸,用两步酶消化法(胶原酶和胰蛋白酶)和差速贴壁法来纯化SSC细胞.用不同的饲养层(小鼠胎儿成纤维细胞(mouse em...     

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法（0.25%胰酶处理1 h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6 h）培养驴皮组织3 d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15 d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。     

Study on in vitro Culture of Donkey Skin Fibroblasts

This study was aimed to compare different culture methods for donkey skin fibroblasts to establish a highly efficient and rapid culture system. The dermal tissue of the healthy and 6-7 year old Xinjiang donkey was cultured for primary cells of skin fibroblast with tissue explants adherent method and double enzyme digestion method. Then,the growth characteristics,proliferation,cell cycle and mycoplasma contamination were detected and analyzed. The results showed that the fibroblast cells entered the logarithmic growth phase after cultured for 3 days by double enzyme digestion(0.25% trypsin digestion for 1 h and then 0.5% collagenase Ⅰ for 6 h), while it required 15 days with tissue explants adherent method. Flow cytometry analysis showed that nearly half of the cells were in G0/G1 stage,the other half in S+G2+M stage, while just 5.17% of the cells were apoptosis,which indicated that most of the cells were in the active stage of division and proliferation,and had strong vitality. Moreover, there was no mycoplasma contamination in the cultured cells. In summary,the culture system of donkey skin fibroblasts was rapidly and effectively established with the double enzyme digestion method in vitro.     

脂质体介导抗猪瘟病毒基因转染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

本研究旨在探索脂质体介导抗猪瘟病毒基因重组质粒PGPUG/GFP/Neo转染小鼠胚胎成纤维细胞的条件,为构建疾病模型动物及抗猪瘟病毒转基因猪提供技术平台。本研究比较了不同的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养方法,将培养至3~5代的胚胎儿成纤维细胞,通过脂质体(LiPofectamine^TM 2000)介导转染抗猪瘟病毒基因重组质粒PGPUG/GFP/Neo。结果显示,在所选用的不同浓度脂质体和重组质粒,以及不同转染时间的组合中,2 μL脂质体介导1.5 μg重组质粒,转染6 h时可获得19%的转染效率,极显著高于其他剂量和时间组合(P＜0.01)。这些结果表明,脂质体、重组质粒及转染时间的优化组合,能有效介导抗猪瘟病毒基因重组质粒PGPUG/GFP/Neo转染小鼠胚胎成纤维细胞。     

从原始生殖细胞分离和克隆兔的胚胎生殖细胞

研究采用 1 4～ 1 8d兔胎儿的生殖嵴及周围组织与其同源成纤维细胞共培养 ,低糖DMEM +1 0 %NBS +1 0 %FCS +1 0ng/mLLIF +1 0ng/mLSCF+0 1mol/Lβ 巯基乙醇 +1 0 0U/mL青霉素 +80U/mL链霉素作培养基 ,分离出兔原始生殖细胞 (PGC) ,克隆并多次传代。从原始生殖细胞 (PGC)中获得胚胎生殖细胞 (EG)细胞集落 ,1 4d胎儿原代观察到类EG细胞集落 ,传至 4代后丢失。 1 6d胎儿的类EG只传 2代 ,1 8d胎儿没有得到EG细胞集落。EG细胞具有干细胞的诸多特征 ,呈典型的团块状聚集生长 ,碱性磷酸酶 (AKP)染色呈阳性 ,在衰老饲养层的培养基中生长形成类胚体、上皮细胞、神经细胞和成纤维细胞等