不同生长环境下水稻穗抽出度3个相关性状QTL定位研究

在3个生长环境下种植水稻Nipponbare/Kasalath//Nipponbare 回交重组自交系（backcross inbred lines,BILs）98个家系(BC1F12和BC1F13)及其亲本,调查剑叶叶鞘长度、最上节间长和包颈长度,运用复合区间作图方法（CIM）,在全基因组5％显著水平上,对这3个性状进行了QTL分析。结果表明,共检测到3个剑叶叶鞘长度性状的QTL,分布于第1、3、4染色体,解释表型变异的12.83%~18.50%;qFLL-1位点在3个环境中均被检测到,增效等位基因来自Nipponbare,qFLL-3和qFLL-4位点在单个环境中被检测到,增效等位基因均来自Kasalath。共检测到3个最上节间长度性状的QTL,分别位于第1、3、6染色体,解释表型变异的5.64%~14.18%;qUIL-6位点在3个环境中都被检测到,增效等位基因来自Nipponbare,其余2个QTL均在2个环境中被检测到,增效等位基因均来自Kasalath。共检测到4个包颈长度性状的QTL,分布于第1、3、5、10染色体,解释表型变异的6.8%~17.76%;qPEL-10在3个环境中均被检测到,qPEL-5在两个环境中被检测到,这两个位点增效等位基因来自Nipponbare,其余2个位点分别在单个环境中被检测到,增效等位基因均来自Kasalath。     

结实期灌溉方式对水稻品质和不同器官镉浓度与分配的影响

旨在探讨在土壤镉（Cd）污染条件下,能否通过合适的灌溉方式改善稻米品质并减少Cd在籽粒中的分配。盆栽扬粳9538（粳稻）和扬稻6号（籼稻）,于移栽前加Cd 150 mg kg-1（Cd处理）,以未加Cd为对照（CK）。自抽穗后7 d至成熟设置3种灌溉方式,即保持水层(WW);轻干-湿交替灌溉(MD,土壤落干至土壤水势为－20 kPa时复水);重干-湿交替灌溉(SD,土壤落干至土壤水势为－40 kPa时复水)。结果表明,在土壤Cd浓度相同条件下,与WW比较,MD显著增加结实率、千粒重、产量、稻米的出糙率、精米率和整精米率,显著降低垩白度,SD的结果则相反。Cd处理对结实率、千粒重和稻米品质各指标无显著影响。在Cd处理条件下,与WW相比,MD和SD显著增加Cd在根系的浓度和分配比例,降低Cd在茎叶的浓度和在籽粒的分配比例。籽粒和精米中Cd浓度,SD显著高于WW,MD与WW无显著差异。Cd在精米的分配比例则SD显著低于MD和WW。两品种结果趋势一致。说明结实期轻干-湿交替灌溉可以增加产量、改善稻米的加工和外观品质,并可不增加甚至降低Cd在籽粒中的浓度及分配比例。从根系活性、叶片光合特性以及Cd的转运等方面分析了在不同灌溉方式下产量、品质及不同器官Cd浓度与分配差异的原因。     

不同种植密度下的夏玉米冠层结构及光合特性

研究了种植密度对夏播玉米(CF008、郑单958和金海5号）冠层结构及光合特性的影响,目的是通过密度调控,构建高效冠层,发挥品种潜力,同时确立不同夏玉米品种高产高效冠层的定量化技术指标。结果表明,3个夏玉米品种均在中或低密度下（CF008为9.75和11.25万株 hm-2,郑单958为8.25和9.75万株 hm^-2,金海5号为6.75和8.25万株 hm^-2）构建的冠层较合理,冠层光合性能较高。冠层内透光率、叶夹角、茎粗、叶绿素相对含量（SPAD值）和净光合速率（Pn）均随着密度的增加而降低,说明高密度易造成群体内光分布不合理,导致光合性能的降低。灌浆中期前群体光合势（LAD）和叶面积指数（LAI）均表现为中或高密度条件下较高,而后为中或低密度下较高,并且吐丝后LAD所占比率为中或低密度处理显著高于高密度处理,说明高密度条件下冠层结构不合理,造成生育后期叶片提早衰老。在中或低密度下,群体穗位层透光率较大,吐丝期和灌浆中期分别为13.4%~19.45%和16.19%~21.48%;叶面积发展动态较为合理,吐丝期LAI达5.59~6.75,成熟期仍然保持在2.24~3.68,尤其中上层叶片LAI高值持续期较长;吐丝期中上层叶片Pn达到33.6~43.8 μmol CO2 m^-2 s^-1;吐丝后的群体LAD较高,特别是中密度下LAD达172.01~235.91 m2 d m-2,后期光合面积持续时间较长,更有利于玉米产量的提高。     

叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性

根据已构建的大豆叶绿体表达载体pJY01,设计特异性引物,将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中构成叶绿体表达载体pJY01-MpAFP149,利用基因枪轰击法转化烟草,经壮观霉素筛选获得4株叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草株系。PCR和PCR-Southern结果显示外源基因已整合至烟草叶绿体基因组中但同质化水平不高,RT-PCR结果也表明昆虫抗冻蛋白基因已发生了转录。将野生型烟草、叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草及核转化T₁代转抗冻蛋白基因烟草(pCAMBIA1302- MpAFP149)于–1℃低温处理3 d,观察耐寒表型及测定相对电导率。结果表明, 叶绿体型转基因烟草的耐寒表型优于野生型烟草,但与核转化的T₁代转抗冻蛋白基因烟草无显著差异。处理3 d时,叶绿体型转基因烟草和T₁代转抗冻蛋白基因烟草的电导率分别为39.2%和38.2%,而野生型烟草已达73.7%。本实验获得的异质化转叶绿体抗冻蛋白基因烟草与转核基因烟草的耐寒力无差异。     

水稻(Oryza sativa L.)a-淀粉酶基因的进化及组织表达模式

α-淀粉酶在植物特别是谷类萌发种子淀粉降解中具有重要作用。水稻α-淀粉酶基因的结构、进化和表达研究已有报道,但是,多集中于OsAmy1和OsAmy3这两个亚族内基因间以及发芽种子中。不同亚族间的基因结构、进化及更多组织和时期的表达特点尚缺乏细致研究。本研究通过TblastN同源性比对及保守结构域分析揭示水稻基因组含有11个α-淀粉酶基因。生物信息学分析、系统进化树构建及半定量RT-PCR分析表明,该家族基因在结构上发生了明显的分化,具有清晰的进化层次,OsAmy5A和OsAmy4A是家族中较原始状态的基因;在表达和功能上也发生了明显分化,进化水平较高的基因发生了明显的时空表达特异性分化。OsAmy1A、OsAmy3A及OsAmy3D和OsAmy3E分别在保证种子植物世代传递、维持种子休眠过程中胚的微弱生命活动及保证种子萌发过程中能量的稳定持续供应上具有重要作用。     

花生生育早期耐涝性室内鉴定对大田期的意义

为探索花生不同品种生育早期耐涝性差异及与大田耐涝性的关系,对8个品种的种子进行室内180 h浅、深水处理,对幼苗进行10 d淹涝和大田短（10 d）、长期（88 d）湿涝,测定发芽能力、幼苗生长发育和乙醇脱氢酶（ADH）活性、大田湿涝产量（WY10、WY88）和产量耐性系数（WTC10、WTC88）。结果表明,(1)花生对淹涝较敏感,其耐涝性因淹涝时期、程度（水深）和品种而异。浅涝时种子先露尖而后发芽;深涝时只露尖而不能形成幼芽。不同品种发芽期耐涝性差异较大。幼苗的根部受害程度远甚于地上部,根色、根重是不同品种耐性差异的主要表征指标。(2)花生幼苗根系ADH活性受淹涝即厌氧诱导的效应极为明显,其中淹涝3~10 d的ADH活性与耐涝性负相关,尤其是淹涝10 d后ADH活性高的品种,植株发育不良。(3)与大田所有产量耐涝性指标的相关性,ADH活性、根色均为负相关,单株根重、单株地上部重、单株总重则为正相关,尤其是根重与WY10 2年均呈显著正相关。(4)耐涝性鉴定时间,在发芽期浅、深水中分别以180、120 h为宜,幼苗期以3~10 d为宜。因此,花生生育早期耐涝性室内鉴定对大田期有重要参考价值。     

稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

设计含MluⅠ酶切位点的接头,将其连接入经KpnⅠ和BamHⅠ酶切后的质粒pCAMBIA2300-U-bi-Ocs,得到pCAMBIA2300-Ubi-adaptor-Ocs。设计含有KpnⅠ和MluⅠ酶切位点的引物,以稻瘟菌基因组DNA为模板扩增得到pemG1序列。将其连接入pMD18-T得到pMD18-T-pemG1。最后,用KpnⅠ和MluⅠ从pMD18-T-pemG1切下pemG1基因片段,将其连接入pCAMBIA2300-Ubi-adaptor-Ocs的KpnⅠ-MluⅠ酶切位点,构建成稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs。用冻融法将pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs导入根癌农杆菌菌株AGL-1,再通过根癌农杆菌介导转化获得了转基因烟草株系。用PCR,Northern和Western杂交验证了pemG1基因在受体烟草基因组中的整合,转录和表达。此研究为下一步通过稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达来提高转基因烟草的抗病性打下了基础。     

人β淀粉样蛋白基因植物表达载体的构建及转化

人β淀粉样蛋白(Amyloid β peptide,Aβ)是治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的关键靶标之一.本试验利用重叠PCR技术获得2Aβ串联基因片段,并将其克隆到植物表达载体pBIDST(含双35S启动子和TEV增强子)中.用根癌农杆菌EHA105介导转化烟草,筛选获得了卡那霉素抗性植株.PCR和RT-PCR检测结果证实2Aβ基因已经整合进烟草基因组中并进行了转录.     

种植密度对高产夏玉米登海661产量及干物质积累与分配的影响

选用玉米品种登海661和农大108,设置不同种植密度,研究高产条件下种植密度对夏玉米产量及干物质积累与分配的影响。结果表明,种植密度增加后群体产量和干物质积累量显著增加,单株产量和干物质积累量反之。登海661在9万株 hm^-2时充分发挥了生长潜能,可获高产。随种植密度的增加,开花期和乳熟期茎秆干物质积累量的降幅大于叶片,主要影响茎秆干物质积累;成熟期茎秆干物质积累量降幅小于叶片,主要影响叶片干物质积累。乳熟期以后茎秆和叶片的干物质输出率均随种植密度增加显著减少,茎秆的贡献率随种植密度增加显著减少,而叶片的贡献率,随种植密度增加显著增加。密度3~9万株 hm^-2时茎秆对籽粒干物质积累量贡献率大,10.5~13.5万株 hm^-2时叶片对籽粒库建成影响大。     

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因（GhCYP51G1）的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1 (GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2 kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6 d胚珠、开花后0 d和2 d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8 d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。     

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12 (Gh12)、中棉36 (Gh36)和海岛棉7124 (Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签“PKRRAGRKKFQETRHP”和“FADSAW”。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T₁代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。分析表明,在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。     

结缕草CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证

结缕草是优良的暖季型草坪草之一, 主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料, 根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列, 通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因ZjCBF;根据和其他已报告的CBF序列的比对结果, 我们确定ZjCBF基因属于CBF转录因子家族基因中CBF1型基因。利用半定量PCR和实时定量PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况, 发现ZjCBF基因受冷胁迫的诱导, 在4℃处理6 h时表达量最高。在此基础上, 本研究构建了该基因的过表达载体, 并将其转化到拟南芥中, 通过低温冷处理实验发现, 不论是否经过冷驯化, 转基因ZjCBF的植株由于ZjCBF的过量表达都要比野生型植株抗寒性强。     

烟草乙烯反应突变体的抗冷性及机理分析

为了深入研究乙烯在植物抵抗逆境胁迫中的作用,以烟草为模式植物,利用幼苗对外源乙烯的"三重反应",筛选得到了40多个乙烯不敏感突变体,其中多数突变体具有较强的抗冷性;从中选取4个突变体株系,对它们耐受低温胁迫的生理基础和作用机理进行了分析。结果表明,低温(0℃)胁迫下,烟草乙烯不敏感突变体的电解质渗透率显著低于野生型,而抗氧化酶活性(POD、SOD)以及过氧化氢酶(CAT)活性都高于野生型,说明突变体具有抵抗低温胁迫的优势生理基础。进一步研究发现,低温(0℃)胁迫下,烟草突变体中冷诱导基因Nt CBFs和Nt COR47呈现高水平表达,乙烯信号传导途径中下游基因ERFs的表达也发生显著变化。这些研究为烟草乙烯不敏感突变体株系具有较强的抗冷性提供了直接的分子证据。     

转盐地碱蓬SsDREB基因烟草的抗逆生理机制分析

为了研究盐地碱蓬SsDREB基因在转基因烟草中的功能,探究转基因烟草的抗逆生理机制,我们构建了Ss-DREB基因的植物高效表达载体pCAMBIA2301-SsDREB,并通过农杆菌介导法将其导入烟草NC89中,通过Kan抗性、PCR及RT-PCR 筛选鉴定阳性苗;对转基因烟草苗进行高盐、干旱等抗逆性分析,同时测定在不同浓度 NaCl 和PEG6000处理后转基因烟草叶片的净光合速率( Pn )、气孔导度( Gs )、光能转化效率( Fv/Fm )、实际光量子效率(φPSⅡ)以及脯氨酸和可溶性糖的含量。结果表明：通过Kan抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定,最终获得12个株系转基因阳性苗。转基因植株的抗逆性与对照相比明显提高。在不同浓度NaCl和PEG6000处理下,对照和转基因苗的Pn和Gs随着处理浓度的提高均呈现逐渐下降趋势,但在相同浓度处理下转基因苗的Pn和Gs均比对照高;随着NaCl处理浓度的增大,对照和转基因植株的Fv/Fm和φPSⅡ均逐渐降低,但转基因苗的降低幅度比对照小;随着PEG处理浓度的提高,对照和转基因植株的Fv/Fm逐渐降低,但转基因苗的降低程度较对照小,而φPSⅡ下降趋势基本相同。在不同浓度NaCl和PEG处理后,转基因植株和对照植株脯氨酸和可溶性糖含量均随着NaCl处理浓度的增加而提高,但是转基因植株较对照植株增高更快。     

W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性

W6基因是由普通小麦地方品种小白麦cDNA文库中克隆获得的ERF类转录因子, 属于ERF IV家族。将W6基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pBI121上, 通过农杆菌介导法将其转入烟草新华1号。利用RT-PCR技术分析W6基因的过量表达对下游抗性基因表达水平的影响, 并测定高盐胁迫下转基因烟草的SOD酶活性和叶绿素含量。结果显示, 所检测的转基因烟草阳性株中W6基因均有不同程度的表达, 其耐盐性明显提高。W6基因的表达诱导并增强了含有GCC box的PR(pathogenesis-related)基因和含有DRE/CRT元件的COR/RD基因的表达。在高盐胁迫下, 转基因烟草的SOD酶活性和叶绿素含量明显高于对照。W6基因既能诱导抗病相关的PR基因表达又能诱导与提高非生物胁迫能力的COR/RD基因表达, 可能与生物胁迫和非生物胁迫相关, 证实转录因子W6参与了耐盐胁迫相关基因的调节, W6基因的过表达提高了转基因烟草的耐盐性。     

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从类产碱假单胞菌YSl(Pseudomonas psuedoalcaligenese YSl)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因：phaCl、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对phaCl基因进行了改造，经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaCl)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaCl和phaC2双基因)。将构建好的嵌合phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2，用冻融法转入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHAl05)并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan)。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株，抗性植株大田生长表型正常，生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR-Southern、Southern检测初步确定有32％烟草稳定整合了phaCl和phaC2。用氯仿一次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA，在产物合成水平确证有25．6％的转基因植株。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

转LEA基因烟草的NaHCO3抗性分析

本研究以转LEA基因烟草7个株系及非转基因对照烟草组培苗为材料,用不同浓度的NaHCO3处理,通过调查转基因烟草和对照烟草的相对电导率、POD活性、SOD活性、碱害指数、生根率等指标的变化,对LEA基因功能在NaHCO3的抗性方面进行初步探索性的研究。结果表明,在非碱胁迫条件下,各转基因株系与对照烟草的相对电导率差异不明显,各株系的相对电导率随着NaHCO3浓度的增加均呈上升趋势,但各转基因株系均小于对照烟草,当NaHCO3浓度在30mmol/L和40mmol/L时,转基因株系之间及转基因株系与对照间的差异达到了显著水平;在给予NaHCO3胁迫后,将各转基因株系各个处理POD活性、SOD活性取平均值后与对照烟草做比较,可以看出,对照烟草的POD活性、SOD活性变化较小,而转基因株系活性上升较为明显,且均在NaHCO3浓度为30mmol/L处达到活性最大值;在不同浓度NaHCO3胁迫下转基因烟草的受害程度明显小于对照;在相同浓度的NaHCO3胁迫下,转基因烟草生根较对照烟草早2￣3d,当NaHCO3浓度为30mmol/L时,转基因烟草碱害指数达到50%左右,且保持有10%￣30%左右生根率,而对照烟草受害程度较大,已经不能生根。综合以上分析结果表明,转基因烟草NaHCO3的耐受临界浓度为30mmol/L。在NaHCO3胁迫下,转基因烟草的碱害程度、膜损伤较对照烟草小,POD、SOD活性及生根率均高于对照烟草,说明LEA基因的导入提高了烟草的NaHCO3抗性。     

转金属硫蛋白基因(MT1)烟草抗Cd2+胁迫的生理特性分析

将柽柳(Tamarixsp.)金属硫蛋白基因(MT1,GenBank登录号:AB298390)插入植物表达载体pBI121,取代花椰菜病毒35S启动子下游的gus基因,利用农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导法将MT1导入烟草(Nicotiana tobacum)基因组。对具有卡那霉素抗性,且经PCR-Southern检测和Northern杂交表现阳性的转基因株系进行抗Cd2 分析表明,金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因植株的抗Cd2 能力,在含200μmol L-1和400μmol L-1Cd2 的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株MDA含量及POD活性明显低于非转基因株系,叶绿素含量和SOD活性比非转基因株系明显增加。