山西西葫芦花叶病病原鉴定与部分序列分析

利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病西葫芦进行了分子鉴定。序列测定及分析发现,具有明显花叶和斑驳症状的西葫芦受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的侵染。为进一步明确黄瓜花叶病毒山西西葫芦分离物(CMV-XHL)的分类地位,克隆了CMV-XHL RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-XHL CP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组ⅠB中CMV烟草分离物(CMV-SG)的相似性最高,分别为98.6%和99.5%;MP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物的相似性最高,为93.2%~94.6%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-XHL与中国大多数CMV分离物聚为一类,属于CMV亚组Ⅰ中的成员。研究结果对西葫芦病毒病的防治提供一定的理论依据。     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

黄瓜花叶病毒贵州辣椒分离物外壳蛋白基因序列分析

[目的]分析贵州辣椒主产区黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物的分子变异情况,为抗病毒辣椒品种选育及辣椒病毒病的防控提供科学依据.[方法]以来自贵州省8个县(榕江、大方、石阡、安龙、绥阳、德江、关岭和惠水)的16个辣椒CMV分离物为材料,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增辣椒CMV分离物的CP基因序列,利用DNAMAN和BioEdit对CMV分离物的CP基因序列进行比对分析,用MAGE 7.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树,分析贵州辣椒CMV分离物的遗传多样性.[结果]将16个贵州辣椒CMV分离物的CP基因核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列与CMV亚组代表株系进行一致性比对,结果表明,贵州辣椒CMV分离物与CMV亚组分离物的CP基因核苷酸序列一致性为89.7%~100.0%、CP蛋白氨基酸序列一致性为96.8%~100.0%.系统进化分析结果表明,CMV-DF、CMV-RJ、CMV-SQ、CMV-SY、CMV-DJ与CMV I代表株系聚为一个亚支,但更趋近于CMV亚组IB株系,CMV-HS、CMV-GL、CMV-AL与CMV亚组Ⅱ株系聚为另一个亚支,说明侵染贵州辣椒的CMV株系有两大组群,其中大方、榕江、绥阳、石阡和德江CMV分离物归属于CMV亚组IB株系,惠水、关岭和安龙CMV分离物归属于CMV亚组Ⅱ株系.[结论]不同地域的贵州辣椒CMV株系发生了变异.     

侵染胡椒的黄瓜花叶病毒海南分离物全序列分析及亚组鉴定

对侵染海南胡椒的3个黄瓜花叶病毒分离物(CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT)的全序进行克隆和分析。CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT分离物RNA1全长分别为3 361,3 360,3 359个核苷酸(nt),编码1a蛋白;RNA2全长分别为3 044,3 048,3 046 nt,编码2a和2b蛋白;RNA3全长分别为2 217,2 224,2 216 nt,编码3a和CP蛋白。序列一致性比较结果表明,CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT的RNA1,RNA2,RNA3均与CMV亚组IB CMV-SD序列一致性最高,编码的所有蛋白的氨基酸序列一致性也均与CMV-SD序列一致性最高,其中除了2b氨基酸序列一致性低于90%外,其他蛋白的氨基酸序列的一致性均高于93.5%。RNA3的5'NTR结构分析以及RNA3 5'NTR核苷酸序列和CP氨基酸序列系统进化树分析结果表明CMV-WN1,CMV-DA及CMV-FT均属CMV IB亚组。CP系统进化树中CMV-WN1,CMV-FT与云南胡椒分离物CMV-YNP聚成一簇,而CMV-DA与海南胡椒分离物CMV-HNP独立形成另一个分支。     

黄瓜花叶病毒丹参株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从河北安国具有典型花叶症状的大田丹参叶片中分离到病毒病原 ,经过生物学接种、电镜观察和酶联免疫吸附测定表明该离物与CMV有较近的亲缘关系 (记为CMV DS)。从叶片中提取了该病毒的总RNA ,按照CMV外壳蛋白 (CP)基因前后保守区序列 ,设计合成了 1对特异引物 ,采用RT PCR法扩增了 780bp的全长CP基因的cDNA序列 ,将其克隆到pGEM T载体上 ,并进行序列分析。结果重组克隆序列长为 778bp ,含 1个开放阅读框架 (ORF) ,长度为 65 7nt,编码 2 1 8个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较 ,CMV DS和亚组Ⅰ株系的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性为 93 3%～ 99 4%和95 9%～ 1 0 0 % ;而与亚组Ⅱ株系的核苷酸和氨基酸序列同源性仅为为 78 4%～ 79 0 %和81 2 %～ 83 0 % ,表明CMV DS与CMV亚组Ⅰ的株系较亚组Ⅱ株系同源关系更密切 ,将其划归为CMV亚组IB中 ,这是首次在丹参上发现的CMV株系。     

黄瓜花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

对侵染烟草的黄瓜花叶病毒(CMV)山东分离物(SD1)的外壳蛋白(CP)基因进行克隆和序列分析。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成两条寡聚核苷酸引物,用免疫捕捉PCR的方法对黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因进行了扩增。将所得的PCR产物通过T4DNA连接酶连接到pET-22b(+)载体上,并转化大肠杆菌DH5α。序列分析表明:CMV-SD1的CP基因全长657bp,编码218个氨基酸;其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ的分离物有极高的同源性,达92.7%~94.9%;与亚组Ⅱ的同源性仅为59.3%~59.5%;由此将CMV-SD1分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

鲁粤两省黄瓜花叶病毒辣椒分离物CP基因序列分析及亚组鉴定

从广东和山东呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到2个黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的分离物.利用RT-PCR技术克隆了病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因.核苷酸序列测定表明,CMV-GDLJ和CMV-SDLJ 2个病毒分离物CP基因序列长度为657bp,编码218个氨基酸.2个病毒分离物的CP基因序列与CMV亚组Ⅰ的6个株系CP基因序列同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ的3个株系同源性均低于80%,据此将分离物CMV-GD和CMV-TA归属于CMV亚组Ⅰ.     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定及株系分析

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成 1 对引物,对侵染辣椒的黄瓜花叶病毒湖北分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析.结果表明:湖北省内不同辣椒主产区采集到的样品CP基因之间的核苷酸同源率高达98.2%～99.2%,与CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源率分别为92.1%～96.5%和72.1%～78.1%,并且和亚组Ⅰ中的ⅠB系列株系同源率更高.由此确认这4个CMV分离物属于亚组Ⅰ中的ⅠB成员.     

魔芋花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

采用小RNA测序技术对甘肃省榆中县疑似感染病毒病的当归[(Angelica sinensis(Oliv.)Diels]样品进行测序鉴定,发现样品中含有魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV),通过反转录PCR(RT-PCR)扩增KoMV衣壳蛋白(capsid protein, CP)的cp基因,克隆的KoMV cp基因连接原核表达载体pET-28a(+),导入E.coli Rosetta^TM(DE3)诱导表达蛋白,在Ni-NTA重力柱层析作用下纯化CP融合蛋白,并以此作为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。序列分析表明：KoMV cp基因片段大小为840 bp,编码280个氨基酸的外壳蛋白;与GenBank已注册同源性较高的KoMV分离物相比,核苷酸序列相似性为85.58%～99.41%,氨基酸序列相似性为89.32%～99.29%;KoMV的病毒种群分布存在明显的区域性和寄主差异。SDS-PAGE显示,不同温度诱导下KoMV CP融合蛋白在E.coli Rosetta^TM(DE3)中均以包涵体的形式大量表达,融合蛋...     

云南主要地区辣椒分离的黄瓜花叶病毒的亚组鉴定*

 在云南富民、砚山、邱北和南涧等云南主要辣椒产区采集了28个病毒样品,选择应用RT-PCR,Msp I以及EcoR I酶切和克隆测序等分子生物学手段对其中的7种进行检测。经过RT-PCR实验确定其病原为黄瓜花叶病毒（CMV）,同时分离物的Msp I酶切图谱与CMV亚组I的酶切图谱很相似,经EcoR I酶切后也没有出现异常差异。进一步对所检测的黄瓜花叶病毒分离物的外壳蛋白基因进行克隆测序,结果表明,分离物的核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物的核苷酸序列有极高的同源性,达93%~98%; 而与亚组II株系的核苷酸序列同源性仅为77%。因此将所分离到的黄瓜花叶病毒分离物归属于黄瓜花叶病毒亚组I。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT－PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV－PE）全长RNA3。经核苷酸序列测定，明确PE分离物RNA3全长2216nt，含有2个开放阅读框（ORDF），其中5'端的ORF（121－963nt)编码279aa的3a蛋白，3'端ORF（1260－1916nt)编码218aa的CP蛋白。5'端非编码区（NR）长120nt，基因间隔区（IP）长296nt，3'端NR区含301个碱.PE分离物编码的3a蛋白最明显的特征是在136－141位有一个独特的VWCLSS区域，将CMV－PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码 区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关。     

北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花叶病毒CP基因序列分析及亚组鉴定

从宁夏和北京地区甜椒上分离到3个黄瓜花叶病毒分离物(宁夏分离物为CMV-NX1,NX2;北京分离物为CMV-BJ)并保存在普通烟上。从叶片中提取该病毒RNA,经RT-PCR扩增到780bp的全长CP基因的cDNA,PCR产物纯化并测序。2个宁夏分离物(NX1,NX2)核甘酸序列同源性为100%,它们为同一株系。与已报道的部分CMV株系的CP基因序列相比较,表明3个分离物与CMV亚组I同源关系比亚组II更密切,因而3个分离物都属于黄瓜花叶病毒亚组I,通过DAS-ELISA进一步验证它们都属于亚组I。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

黄瓜花叶病毒在洛阳地区的发生及亚组鉴定

【目的】明确黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)在洛阳地区主要蔬菜作物上的发生情况及其亚组类型,为该地区蔬菜作物上CMV的田间诊断和预防监测,防止CMV在该地区的大规模暴发等提供重要的理论依据。【方法】对采自洛阳地区的茄科、葫芦科和豆科等疑似病毒病蔬菜作物进行CMV的RT-PCR检测鉴定,利用相关分子生物学软件对获得的CMV CP基因进行序列分析,并构建系统进化树。【结果】86份疑似病毒病蔬菜样品中共检出CMV样品13份,检出率为15.12%,在番茄、辣椒、菜豆和花生上均有发生,该4个CMV CP基因核苷酸同源性为90.8%～98.8%,与已报道的CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ分离物构建系统进化树发现该4种作物上的CMV分离物均为亚组Ⅰ病毒。【结论】CMV在洛阳地区茄科和豆科蔬菜作物上均有发生,且CMV Ⅱ可能为侵染的优势种病毒,应提前在作物种植早期做好蚜虫防控工作,并应在相关作物上积极开展CMV Ⅰ的抗病育种工作。     

云南昭通苹果产区苹果花叶病毒的鉴定

 研究通过电镜、免疫捕获RT PCR的方法,对云南昭通表现花叶的苹果病样进行鉴定,电镜观察到直径为26～35 nm,无包膜二十面体的准等轴对称病毒颗粒,与苹果花叶病毒（Apple mosaic virus,ApMV）相似。根据苹果花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,提取病毒病样品总RNA,进行扩增、克隆和测序。序列分析表明侵染云南昭通的苹果花叶病病原为ApMV。把本试验鉴定的苹果花叶病毒与已报道的31个苹果花叶病毒分离物进行序列比对和分析。所有的ApMV分离物可以划为3个亚组。其中,亚组Ⅰ、亚组Ⅱ中均有侵染苹果的ApMV分离物。亚组Ⅰ寄主分化较多,亚组Ⅱ多为苹果分离物,而梨分离物单独聚在亚组III。本研究的云南昭通ApMV分离物（ZT）与昆明斗南月季分离物（Kmi2）,美国分离物（NCGR9026）、捷克共和国分离物4个分离物（Cz1,Cz2,Cz3,Cz5）、德国分离物（G1）聚为寄主分化较多的亚组Ⅰ,与昆明斗南月季分离物Kmi2的核苷酸序列同源性最高,相似性达到998%。本研究为研究云南ApMV分子变异、与寄主的互作和指导防控提供依据。     

云南香料烟花叶病病原分离物的鉴定

从云南保山采集具典型花叶症状的香料烟病株，用病株汁液接种心叶烟，进行单斑分离纯化。电子显微镜观察到杆状病毒粒体（18nm×300nm），三抗体夹心酶联免疫吸附（TAS-EUSA）检测与烟草花叶病毒（Tobaccomma／cv／nu，TMV）抗血清呈阳性反应；用TMV外壳蛋白（CP）基因特异性引物进行RT-PCR扩增，克隆，经序列测定分析，侵染云南保山香料烟的病原分离物CP基因含480个核苷酸，编码159个氨基酸，通过核苷酸和氨基酸序列分析，与TMV-152的相似性最高，核苷酸序列的相似性为98．8％，推导编码氨基酸相似性达到100．0％，亲缘关系最近。根据这些特性，引起云南保山香料烟花叶病的病原分离物是烟草花叶病毒的一个分离物。     

西瓜花叶病毒(WMV)外壳蛋白基因克隆及序列分析

[目的]研究新疆甜瓜主栽区西瓜花叶病毒(WMV)外壳蛋白的分类地位,以及与国内外分离株亲缘关系.[方法]田间采集具有西瓜花叶病毒症状的幼嫩叶片,利用改良的TRIZOL总RNA提取法获取RNA,进一步分离纯化、克隆及测序,将测序结果利用BLAST、DNAMAN 5.0、CLUSTAL X、MEGA 5.0 EXPASY、TM-HMM等软件进行碱基和氨基酸序列比对,以及疏水性平均值、脂肪系数、亲缘关系等分析.[结果]序列比对发现8个地区WMV病毒外壳蛋白核酸序列的5'端保守性较高,碱基和氨基酸序列相似性分别达到86.25;和93.01;,存在部分碱基和氨基酸突变,相似性较高.[结论]通过分子进化树可得出新疆8个分离物之间亲缘性关系较近,同源性较高,与国内外其它地区的亲缘性关系较远、同源性较低.     

水稻条纹病毒安徽分离物CP基因的克隆及序列分析

采集安徽庐江水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA.设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒安徽分离物(RSV-AH)的RNA3部分片段,克隆并测序.序列分析表明,该片段全长1051个核苷酸,其中包含的CP基因全长969个核苷酸,编码322个氨基酸.将RSV安徽分离物CP基因(AH-CP)与其它来源的RSV CP基因进行核甘酸序列相似性比较,结果表明,安徽庐江的RSV CP基因与江苏洪泽的RSV CP基因序列相似性最高,达99.3%.进一步构建RSV CP基因系统关系树,发现安徽庐江的RSV CP基因同样与江苏洪泽的RSV CP基因亲缘关系最近.